本發(fā)明屬于呼吸道病原體檢測(cè)，具體涉及一種聯(lián)合多重pcr及crispr-cas的快速檢測(cè)呼吸道病原體核酸的試劑盒及使用該試劑盒的方法。

背景技術(shù)：

1、呼吸道病原體，包括細(xì)菌、病毒、真菌和寄生蟲，是引起呼吸系統(tǒng)感染的主要原因。這些病原體通過空氣傳播、接觸傳播或其他方式進(jìn)入人體，導(dǎo)致從輕微到嚴(yán)重的呼吸道疾病。近年來，隨著新發(fā)傳染病的出現(xiàn)和傳統(tǒng)疾病的復(fù)燃，呼吸道病原體的檢測(cè)技術(shù)在公共衛(wèi)生和臨床醫(yī)學(xué)中變得越來越重要。

2、呼吸道病原體引起的疾病不僅影響患者的健康，還對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生系統(tǒng)帶來巨大的負(fù)擔(dān)。常見的呼吸道病原體包括：

3、細(xì)菌：如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血桿菌。

4、病毒：如流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠狀病毒(包括sars-cov、mers-cov和sars-cov-2)和副流感病毒。

5、真菌：如曲霉菌、新型隱球菌和念珠菌。

6、這些病原體可以引起一系列呼吸道疾病，從普通感冒、急性支氣管炎到嚴(yán)重的肺炎、急性呼吸窘迫綜合征(ards)和肺結(jié)核等。兒童、老人和免疫力低下的人群是這些疾病的高危人群。

7、早期、準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)對(duì)于控制疾病傳播和制定治療方案至關(guān)重要。通過準(zhǔn)確的病原體檢測(cè)，可以幫助臨床醫(yī)生制定精準(zhǔn)治療方案：避免濫用抗生素，減少耐藥性菌株的產(chǎn)生；可以監(jiān)測(cè)疾病的流行情況：及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制傳染病的爆發(fā)，防止大規(guī)模流行；可以提高公共衛(wèi)生應(yīng)對(duì)能力：特別是在面對(duì)新發(fā)傳染病時(shí)，快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)可以極大地提高公共衛(wèi)生應(yīng)對(duì)的效率和效果。

8、傳統(tǒng)檢測(cè)呼吸道病原體的方法包括細(xì)菌培養(yǎng)、顯微鏡檢查、免疫學(xué)方法。

9、細(xì)菌培養(yǎng)是傳統(tǒng)的病原體檢測(cè)方法之一。通過在特定培養(yǎng)基上生長(zhǎng)細(xì)菌，可以鑒定出具體的病原體并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。這種方法雖然準(zhǔn)確性高，但耗時(shí)較長(zhǎng)(通常需24-48小時(shí))，對(duì)于一些難以培養(yǎng)的細(xì)菌或病毒檢測(cè)效果有限。

10、顯微鏡檢查可以直接觀察病原體的形態(tài)，常用于檢測(cè)細(xì)菌和寄生蟲。雖然操作簡(jiǎn)便，但靈敏度和特異性較低，依賴于技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)。

11、酶聯(lián)免疫吸試驗(yàn)(elisa)和熒光免疫檢測(cè)技術(shù)通過檢測(cè)血清中的抗體或抗原來識(shí)別病原體。這些方法靈敏度和特異性較高，適用于大規(guī)模篩查，但需要較長(zhǎng)時(shí)間才能得出結(jié)果。

12、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)近年來取得了顯著的發(fā)展，特別是在基因編輯、疾病和病原體檢測(cè)和生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、逆轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)、下一代測(cè)序(ngs)等。

13、pcr技術(shù)，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量pcr(qpcr)，能夠在短時(shí)間內(nèi)高效擴(kuò)增和檢測(cè)病原體的核酸。其高靈敏度和特異性使其成為目前最廣泛使用的檢測(cè)技術(shù)之一。然而，pcr檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和技術(shù)人員的要求較高，成本較高。

14、rt-pcr用于檢測(cè)rna病毒(如流感病毒和冠狀病毒)，通過逆轉(zhuǎn)錄將rna轉(zhuǎn)化為dna，再進(jìn)行pcr擴(kuò)增。雖然操作步驟復(fù)雜，但在rna病毒檢測(cè)中具有極高的靈敏度和特異性。

15、ngs技術(shù)是一種高通量的dna測(cè)序技術(shù)，能夠在短時(shí)間內(nèi)并行測(cè)序大量dna片段。與傳統(tǒng)的sanger測(cè)序相比，ngs技術(shù)具有更高的靈敏度和通量，能夠?qū)?fù)雜基因組進(jìn)行全面分析，發(fā)現(xiàn)已知和未知的病原體，特別適用于復(fù)雜感染和多重病原體檢測(cè)。但是費(fèi)用較高，測(cè)序設(shè)備和試劑費(fèi)用較高，限制了在資源有限地區(qū)的廣泛應(yīng)用；數(shù)據(jù)分析復(fù)雜：需要強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力，處理和解讀海量數(shù)據(jù)；樣本處理要求高：需要高質(zhì)量的樣本提取和文庫構(gòu)建，以保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

16、快速檢測(cè)技術(shù)在呼吸道病原體檢測(cè)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，能夠在短時(shí)間內(nèi)提供準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，有助于及時(shí)診斷和控制疾病傳播。幾種常見的快速檢測(cè)技術(shù)包括免疫層析試驗(yàn)(immunochromatographic?test,ict)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinasepolymeraseamplification,rpa)、核酸序列依賴擴(kuò)增(nucleicacid?sequence-basedamplification,nasba)、crispr/cas系統(tǒng)等。

17、免疫層析試驗(yàn)是一種基于抗原-抗體反應(yīng)的快速檢測(cè)技術(shù)，通常用于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。ict包括試紙條和卡式裝置，通過毛細(xì)作用將樣本和標(biāo)記抗體移動(dòng)到檢測(cè)區(qū)域。具有操作簡(jiǎn)便、快速、多樣性等特點(diǎn)。但靈敏度和特異性相對(duì)較低，容易出現(xiàn)假陰性或假陽性結(jié)果。

18、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)是一種高效、快速的dna擴(kuò)增技術(shù)，能夠在恒定溫度下(60-65℃)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。lamp技術(shù)利用四種特異性引物識(shí)別目標(biāo)dna的六個(gè)不同區(qū)域，結(jié)合鏈置換dna聚合酶，在短時(shí)間內(nèi)(通常不到1小時(shí))大量擴(kuò)增目標(biāo)dna。具有操作簡(jiǎn)便、速度快，對(duì)設(shè)備要求較低的優(yōu)勢(shì)。但是可能需要針對(duì)不同病原體設(shè)計(jì)特異性引物，應(yīng)用范圍有限。

19、重組酶聚合酶擴(kuò)增(rpa)是一種在恒定低溫(約37-42℃)下進(jìn)行的核酸擴(kuò)增技術(shù)。rpa利用重組酶、dna聚合酶和單鏈結(jié)合蛋白在恒定溫度下進(jìn)行擴(kuò)增。具有反應(yīng)迅速、靈敏度高，可在常溫條件下進(jìn)行，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。同樣，與lamp類似，需設(shè)計(jì)特異性引物，且在實(shí)際應(yīng)用中仍需優(yōu)化。

20、nasba是一種特異性擴(kuò)增rna分子的技術(shù)，常用于病毒rna的檢測(cè)。nasba在恒定溫度下(41℃)進(jìn)行，利用逆轉(zhuǎn)錄酶、rnase?h和t7?rna聚合酶，能夠?qū)na逆轉(zhuǎn)錄成cdna，并通過rna聚合酶擴(kuò)增。適用于rna病毒的檢測(cè)。但也存在復(fù)雜的樣本處理、rna降解風(fēng)險(xiǎn)、引物設(shè)計(jì)難度大、定量能力有限、結(jié)果解讀復(fù)雜、設(shè)備和試劑依賴性高、成本較高和交叉污染風(fēng)險(xiǎn)等劣勢(shì)。

21、crispr/cas系統(tǒng)在病原體診斷中通常利用cas蛋白(如cas9、cas12、cas13)的核酸酶活性，結(jié)合特異性導(dǎo)向rna(grna或crrna)，識(shí)別和切割目標(biāo)病原體的核酸序列(dna或rna)。兩種常用的crispr診斷平臺(tái)：sherlock(specific?high-sensitivity?enzymaticreporterunlocking)和detectr(dna?endonuclease-targeted?crispr?trans?reporter)

22、sherlock診斷平臺(tái)，用于rna靶標(biāo)檢測(cè)。cas13a在識(shí)別到特定rna序列后，觸發(fā)其rna酶活性，導(dǎo)致周圍rna分子(包括報(bào)告rna)被切割。通過報(bào)告rna的切割產(chǎn)生熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大和可視化檢測(cè)。

23、detectr診斷平臺(tái)，用于dna靶標(biāo)檢測(cè)。cas12a在識(shí)別到特定dna序列后，觸發(fā)其非特異性單鏈dna酶活性，切割周圍的報(bào)告單鏈dna(ssdna)。通過報(bào)告ssdna的切割產(chǎn)生熒光或比色信號(hào)，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大和可視化檢測(cè)。

24、盡管呼吸道病原體的檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，但仍面臨一些挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度；開發(fā)能夠同時(shí)高通量檢測(cè)多種病原體的技術(shù)，以應(yīng)對(duì)復(fù)雜感染情況；進(jìn)一步降低檢測(cè)成本，提升在資源有限地區(qū)的可及性；快速識(shí)別和檢測(cè)新出現(xiàn)的病原體，如新型冠狀病毒。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于提供了一種基于多重pcr及crispr-cas的快速檢測(cè)呼吸道病原體核酸的試劑盒，該試劑盒能夠同時(shí)高通量檢測(cè)178種呼吸道病原體，提高呼吸道病原體的檢測(cè)靈敏度和特異性。相比于目前的熒光定量pcr和ngs檢測(cè)技術(shù)，本試劑盒可同時(shí)大批量檢測(cè)多種靶標(biāo)、不需要精密測(cè)序儀器，擴(kuò)增檢測(cè)產(chǎn)物被crispr-cas蛋白切割，不易產(chǎn)生污染，具有成本低、靶標(biāo)多、易部署等特點(diǎn)，可用于推廣病原體的分子檢測(cè)，為臨床診斷或/和科學(xué)研究提供更有效的工具。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種多重pcr結(jié)合crispr-cas快速檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒，所述試劑盒包括多重?cái)U(kuò)增引物組合、裝填sgrna的sgrna檢測(cè)板、dna聚合酶、rna逆轉(zhuǎn)錄酶、crispr/cas蛋白、熒光報(bào)告探針；

4、所述多重?cái)U(kuò)增引物組合為seq?no?1～374所示序列；

5、所述sgrna檢測(cè)板為陣列式微孔板，每個(gè)檢測(cè)孔分別裝填有seq?no?383～569所示sgrna中的一種。

6、微孔板可以為24孔板、48孔板、96孔板、384孔板等。

7、所述crispr/cas蛋白優(yōu)選cas12a蛋白。

8、本發(fā)明檢測(cè)的呼吸道病原體為以下178種呼吸道病原體中的一種或多種：

9、大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、流感嗜血桿菌、紋帶棒狀桿菌、奇異變形桿菌、陰溝腸桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、糞腸球菌、肺炎鏈球菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、卡他莫拉氏菌、惠普爾養(yǎng)障體、嗜肺軍團(tuán)菌、皮疽諾卡菌、百日咳鮑特菌、副血鏈球菌、巴西諾卡菌、豚鼠諾卡菌、星型諾卡菌、化膿鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、鳥分枝桿菌復(fù)合群、肺炎支原體、肺炎衣原體、鸚鵡熱衣原體、日本立克次氏體、人型支原體、約旦軍團(tuán)菌、辛辛那提軍團(tuán)菌、橡樹嶺軍團(tuán)菌、沃氏軍團(tuán)菌、耶氏耶肺孢子菌、新型隱球菌、土曲霉、煙曲霉、黃曲霉、熱帶念珠菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、微小根毛霉、米根霉、馬爾尼菲籃狀菌、尖端賽多孢子菌、黑曲霉、小孢根霉、灰色小克銀漢霉、瓦氏軍團(tuán)菌、皰疹病毒1型、皰疹病毒3型、皰疹病毒4型、皰疹病毒5型、皰疹病毒6型、皰疹病毒7型、人博卡病毒1型、腺病毒b組、腺病毒c組、腺病毒e組、甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1、副流感病毒3、副流感病毒4、冠狀病毒oc43、冠狀病毒229e、冠狀病毒nl63、冠狀病毒hku1、2019新型冠狀病毒、人偏肺病毒、鼻病毒a、鼻病毒b、鼻病毒c、腸道病毒a組、腸道病毒b組、腸道病毒c組、腸道病毒d組、呼吸道合胞病毒a、呼吸道合胞病毒b、產(chǎn)酸克雷伯菌、醫(yī)院不動(dòng)桿菌、無乳鏈球菌、胃消化鏈球菌、人博卡病毒2型、人博卡病毒3型、人博卡病毒4型、靈長(zhǎng)目紅系細(xì)小病毒1、人多瘤病毒1型、人多瘤病毒2型、人多瘤病毒3型、人多瘤病毒4型、人多瘤病毒5型、圖森軍團(tuán)菌、副百日咳鮑特菌、漢氏巴爾通體、蒼白密螺旋體、脆弱擬桿菌、假結(jié)核棒狀桿菌、白喉棒狀桿菌、害肺戴阿里斯特桿菌、小韋榮氏球菌、克氏檸檬酸桿菌、蠟樣芽胞桿菌群、戈登鏈球菌、馬紅球菌、假肺炎鏈球菌、溶血葡萄球菌、按蚊伊麗莎白菌、新洋蔥伯克霍爾德氏菌、壞死梭桿菌、問號(hào)鉤端螺旋體、血鏈球菌、支氣管敗血鮑特菌、杜氏假絲酵母、耳假絲酵母、擬平滑假絲酵母、似平滑假絲酵母、藤倉鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、匍匐犁頭霉、中間假絲酵母、塔賓曲霉、雜色曲霉、卷枝毛霉、羊流產(chǎn)衣原體、克柔假絲酵母、沙眼衣原體、解脲脲原體、伯氏考克斯氏體、圣海倫斯軍團(tuán)菌、馬賽軍團(tuán)菌、茴香軍團(tuán)菌、菲氏軍團(tuán)菌、伯里亞德軍團(tuán)菌、新蘇格蘭諾卡菌、武田諾卡菌、微白諾卡菌、鰤?mèng)~諾卡菌、南非諾卡菌、米氏克雷伯氏菌、福賽斯坦納菌、懶惰狡詐菌、米爾伊麗莎白菌、摩氏摩根菌、擬肺炎克雷伯菌、缺陷乏養(yǎng)菌、乳明串珠菌、牡蠣諾卡菌、莢膜組織胞漿菌、恥垢分枝桿菌、戈登分枝桿菌、海分枝桿菌、墨西哥諾卡菌、偶發(fā)分枝桿菌、巴黎軍團(tuán)菌、哈氏軍團(tuán)菌、馬氏軍團(tuán)菌、長(zhǎng)灘軍團(tuán)菌、蓋爾森基興諾卡菌、華氏諾卡菌、亞洲諾卡菌、膿腫諾卡菌、萜烯諾卡菌、寡食諾卡菌、非洲諾卡菌、布氏諾卡菌、北京諾卡菌、凹菌落諾卡菌、新金色分枝桿菌。

10、呼吸道病原體和對(duì)應(yīng)的檢測(cè)該病原體靶標(biāo)序列的sgrna如下表所示：

11、

12、

13、

14、

15、

16、

17、進(jìn)一步，所述的熒光報(bào)告探針為一段單鏈dna，其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)；

18、所述基團(tuán)包括但不限于fam、hex、vic、cy5、cy3、rox、tamra；所述熒光淬滅基團(tuán)包括但不限于bhq1、bhq2。

19、所述的單鏈dna可以被crispr/cas蛋白識(shí)別并切割，單鏈dna可以為線性結(jié)構(gòu)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)，線性結(jié)構(gòu)可以為cccccc、ttttt等，優(yōu)選單鏈dna的序列為cccccc。

20、進(jìn)一步的，所述試劑盒包括多重?cái)U(kuò)增體系和檢測(cè)體系，所述多重?cái)U(kuò)增體系包括多重?cái)U(kuò)增引物組合、擴(kuò)增酶、擴(kuò)增緩沖液；所述擴(kuò)增酶包括dna聚合酶、rna逆轉(zhuǎn)錄酶；

21、所述檢測(cè)體系包括裝填sgrna的sgrna檢測(cè)板、crispr/cas蛋白、檢測(cè)液，所述檢測(cè)液包括檢測(cè)緩沖液和熒光報(bào)告探針。

22、優(yōu)選的，所述擴(kuò)增緩沖液包括pcrbuffer、dntp和mgcl2，優(yōu)選所述擴(kuò)增緩沖液包括dntp?0.1～50mm、mgcl21～100mm。pcrbuffer可選用市售pcr擴(kuò)增緩沖液。

23、擴(kuò)增酶的濃度一般為聚合酶10～3000u/μl、逆轉(zhuǎn)錄酶10～3000u/μl。

24、所述多重?cái)U(kuò)增體系用于對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)區(qū)域。

25、所述檢測(cè)緩沖液包括tris-hcl、mgcl2、nacl和dtt(二硫蘇糖醇)；優(yōu)選的所述檢測(cè)緩沖液包括tris-hcl?5～100mm(ph8～9)，mgcl25～150mm，nacl?5～100mm，dtt?1～50mm。

26、所述檢測(cè)體系用于對(duì)多重pcr擴(kuò)增的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行crispr-cas檢測(cè)，具體過程是：sgrna將crispr/cas蛋白引導(dǎo)至靶標(biāo)，識(shí)別到靶標(biāo)后，激活crispr/cas蛋白的反式切割屬性，將熒光報(bào)告探針的單鏈dna切割，釋放熒光基團(tuán)發(fā)光。

27、crispr/cas蛋白的濃度為0.1～10pmol/μl；

28、熒光報(bào)告探針的濃度為0.1～50μm。

29、sgrna的濃度為0.1～10μm。

30、所述試劑盒還可以包括內(nèi)標(biāo)和陰性對(duì)照。

31、所述陰性對(duì)照為102～106cfu/ml人源細(xì)胞；

32、所述內(nèi)標(biāo)包括第一內(nèi)標(biāo)、第二內(nèi)標(biāo)、第三內(nèi)標(biāo)；

33、所述第一內(nèi)標(biāo)為一段1-10pg/μl人工合成dna片段，作為空白dna內(nèi)標(biāo)；

34、所述第二內(nèi)標(biāo)為一種102～106copies/ml空白rna假病毒，作為空白rna內(nèi)標(biāo)；

35、所述第三內(nèi)標(biāo)為0.1-100ng/μl人源egfr片段，作為crispr-cas檢測(cè)內(nèi)標(biāo)。

36、較為優(yōu)選地，第一內(nèi)標(biāo)、第二內(nèi)標(biāo)的多重?cái)U(kuò)增引物為seq?no?375～382所示序列；具體的，第一內(nèi)標(biāo)可擴(kuò)增三個(gè)靶點(diǎn)，引物序列為seq375～578、381、382；第二內(nèi)標(biāo)的擴(kuò)增引物為seq?no?379～380所示序列。

37、較為優(yōu)選的，第一內(nèi)標(biāo)、第二內(nèi)標(biāo)、第三內(nèi)標(biāo)的sgrna的序列為seqno?570～575。

38、具體的，第一內(nèi)標(biāo)靶點(diǎn)1的sgrna序列為seq?no?570、第一內(nèi)標(biāo)靶點(diǎn)2的sgrna序列為seq?no?571，第一內(nèi)標(biāo)靶點(diǎn)3的sgrna序列為seq?no?574；

39、第二內(nèi)標(biāo)的sgrna序列為seq?no?572、第三內(nèi)標(biāo)靶點(diǎn)1的sgrna序列為seqno?573；第三內(nèi)標(biāo)靶點(diǎn)2的sgrna序列為seq?no?575。

40、所述試劑盒還可以包括核酸提取試劑，用于提取待測(cè)樣本的核酸作為模板。

41、或者采用市售的核酸提取試劑盒提取待測(cè)樣本的核酸。

42、本發(fā)明還提供所述多重pcr結(jié)合crispr-cas快速檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒在快速檢測(cè)呼吸道病原體中的應(yīng)用。

43、進(jìn)一步，本發(fā)明還提供利用多重pcr結(jié)合crispr-cas快速檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒，檢測(cè)呼吸道病原體的方法，所述方法包括以下步驟：

44、(1)提取待測(cè)樣本的核酸作為模板；

45、待測(cè)樣本通常為呼吸道樣本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子、胸水等。

46、優(yōu)選的，在待測(cè)樣本中加入第一內(nèi)標(biāo)、第二內(nèi)標(biāo)后提取核酸，作為模板。

47、(2)以提取的核酸為模板，加入多重?cái)U(kuò)增引物組合、擴(kuò)增酶、擴(kuò)增緩沖液配制得到多重pcr反應(yīng)體系，進(jìn)行多重pcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

48、(3)擴(kuò)增產(chǎn)物、crispr/cas蛋白、檢測(cè)液加入sgrna檢測(cè)板中，每個(gè)檢測(cè)孔分別裝填有不同病原體對(duì)應(yīng)的sgrna，每個(gè)檢測(cè)孔配制相同的crispr-cas熒光檢測(cè)反應(yīng)體系，避光反應(yīng)，使用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)，進(jìn)行判定：熒光信號(hào)值為14000以上，判定該檢測(cè)孔對(duì)應(yīng)病原體陽性。

49、所述步驟(2)中，所述多重pcr反應(yīng)體系優(yōu)選為50μl，包括擴(kuò)增緩沖液25μl、擴(kuò)增酶2μl、多重?cái)U(kuò)增引物組合13μl、核酸模板5μl、余量為水。

50、所述步驟(2)中，多重pcr擴(kuò)增的反應(yīng)程序優(yōu)選為：

51、①50℃，15min；

52、②95℃，3min；

53、③95℃，15sec；60℃，75sec；72℃，30sec；45個(gè)循環(huán)。

54、所述步驟(3)中，所述crispr-cas熒光檢測(cè)反應(yīng)體系優(yōu)選50μl，包括檢測(cè)液5μl、crispr/cas蛋白2.5μl、sgrna?10μl、擴(kuò)增產(chǎn)物1μl，余量為水。

55、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，用96孔檢測(cè)板進(jìn)行高通量檢測(cè)時(shí)，優(yōu)選crispr-cas熒光檢測(cè)反應(yīng)體系為50μl，包光條件下，37～42℃(優(yōu)選42℃)反應(yīng)20～30min。

56、所述步驟(3)中，使用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)，是在同一時(shí)間點(diǎn)同時(shí)對(duì)檢測(cè)板上的多個(gè)檢測(cè)孔進(jìn)行檢測(cè)。

57、檢測(cè)板的每個(gè)檢測(cè)孔分別裝填seq?no?383～569所示序列，其中鳥分枝桿菌復(fù)合群擴(kuò)增2個(gè)靶標(biāo)序列，與其互補(bǔ)的兩條sgrna，序列如seq?id?no.415、seq?id?no.416所示，裝填于同一孔中。

58、黃曲霉擴(kuò)增2個(gè)靶標(biāo)序列，與其互補(bǔ)的兩條sgrna，序列如seq?id?no.431、seq?idno.432所示，裝填于同一孔中。

59、白色念珠菌擴(kuò)增2個(gè)靶標(biāo)序列，與其互補(bǔ)的兩條sgrna，序列seq?id?no.434、seqid?no.435所示，裝填于同一孔中。

60、值得注意的是，對(duì)于結(jié)核分枝桿菌和新型隱球菌，各擴(kuò)增2個(gè)靶標(biāo)序列，與其互補(bǔ)2條sgrna，分別裝填于2孔中，即有2個(gè)靶標(biāo)。

61、結(jié)核分枝桿菌的sgrna分別為seq?id?no.409、seq?id?no.410。要求分別裝填seqid?no.409、seq?id?no.410所示序列sgrna的兩孔檢測(cè)孔均為陽性，才能判定結(jié)核分枝桿菌陽性。如果任意孔為陰性，無法判定為結(jié)核分枝桿菌陽性。

62、新型隱球菌的sgrna分別為seq?id?no.427、seq?id?no.428。要求分別裝填seq?idno.427、seq?id?no.428所示序列sgrna的兩孔檢測(cè)孔均為陽性，才能判定新型隱球菌陽性。如果任意孔為陰性，無法判定為新型隱球菌陽性。

63、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，每塊檢測(cè)板均要設(shè)置一空白對(duì)照檢測(cè)孔，第一內(nèi)標(biāo)檢測(cè)孔、第二內(nèi)標(biāo)檢測(cè)孔和第三內(nèi)標(biāo)檢測(cè)孔。

64、空白對(duì)照檢測(cè)孔中不裝填sgrna，只加水作為空白對(duì)照。

65、當(dāng)某一檢測(cè)板上的sgrna對(duì)應(yīng)的病原體全部為dna病原體時(shí)，則可不設(shè)第二內(nèi)標(biāo)檢測(cè)孔，僅設(shè)空白對(duì)照檢測(cè)孔、第一內(nèi)標(biāo)檢測(cè)孔、第三內(nèi)標(biāo)檢測(cè)孔即可。

66、所述步驟(3)中，判定條件可以進(jìn)一步細(xì)化設(shè)定。

67、在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)基底值進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)平均，并設(shè)定標(biāo)化參數(shù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，具體為：

68、①將96孔檢測(cè)板中含有病原體sgrna檢測(cè)孔(不含內(nèi)標(biāo)、對(duì)照孔)的熒光數(shù)值按照從小到大的順序排序，取前60個(gè)數(shù)值，計(jì)算平均值得到nc-av，設(shè)定標(biāo)化系數(shù)＝7000/nc-av1(7000為空白對(duì)照本底值)，所有孔的數(shù)據(jù)乘以標(biāo)化系數(shù)，得到標(biāo)化后的數(shù)據(jù)(取整數(shù))；

69、②檢測(cè)孔的熒光值大于14000，判定為陽性，13000<熒光值≤14000判定為灰區(qū)，熒光值小于13000判定為陰性。

70、本發(fā)明的有益效果在于：

71、1、通過超多重pcr富集技術(shù)對(duì)呼吸道標(biāo)本中的靶標(biāo)核酸進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，一次可同時(shí)擴(kuò)增多種病原體靶標(biāo)核酸，檢測(cè)通量高達(dá)178種病原體。

72、2、超多重pcr實(shí)現(xiàn)了dna和rna靶標(biāo)單管擴(kuò)增，可同時(shí)檢測(cè)病毒和細(xì)菌。

73、3、對(duì)多重pcr產(chǎn)物，通過crispr-cas，對(duì)核酸片段靶點(diǎn)進(jìn)行特異性識(shí)別，激活熒光基團(tuán)，在激發(fā)光作用下形成特定波長(zhǎng)的的熒光信號(hào)，該熒光信號(hào)可被捕捉讀取從而得到病原體擴(kuò)增片段是否存在的信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原微生物核酸的定性檢測(cè)。

74、4、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單，無需昂貴且精密的熒光定量pcr儀器、測(cè)序儀，設(shè)備低廉，成本低、適用范圍更廣泛。

75、5、擴(kuò)增產(chǎn)物被crispr-cas蛋白切割，不易產(chǎn)生病原體污染。

76、6、本發(fā)明方法靈敏度高、特異性高、成本低、時(shí)間短、特異性高、靈敏度高等特點(diǎn)，能為臨床上診斷病原體的感染提供分子水平的判斷依據(jù)和幫助。