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      一種多重PCR結(jié)合CRISPR-Cas快速檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒的制作方法

      文檔序號(hào):40282446發(fā)布日期:2024-12-11 13:23閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

      技術(shù)特征:

      1.一種多重pcr結(jié)合crispr-cas快速檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒,其特征在于所述試劑盒包括多重?cái)U(kuò)增引物組合、裝填sgrna的sgrna檢測(cè)板、dna聚合酶、rna逆轉(zhuǎn)錄酶、crispr/cas蛋白、熒光報(bào)告探針;

      2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于呼吸道病原體為以下178種呼吸道病原體中的一種或多種:

      3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述crispr/cas蛋白為cas12a蛋白。

      4.如權(quán)利要求2所述的試劑盒,其特征在于所述呼吸道病原體和對(duì)應(yīng)的檢測(cè)該病原體靶標(biāo)序列的sgrna如下表所示:

      5.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述的熒光報(bào)告探針為一段單鏈dna,其5’端標(biāo)記有熒光基團(tuán),3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán);

      6.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述試劑盒包括多重?cái)U(kuò)增體系和檢測(cè)體系,所述多重?cái)U(kuò)增體系包括多重?cái)U(kuò)增引物組合、擴(kuò)增酶、擴(kuò)增緩沖液;所述擴(kuò)增酶包括dna聚合酶、rna逆轉(zhuǎn)錄酶;

      7.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于所述試劑盒包括內(nèi)標(biāo)和陰性對(duì)照;

      8.利用權(quán)利要求1~7之一任一項(xiàng)所述的多重pcr結(jié)合crispr-cas快速檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒,高通量檢測(cè)呼吸道病原體的方法,其特征在于所述方法包括以下步驟:

      9.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于所述步驟(3)的反應(yīng)條件為:避光條件下,37~42℃反應(yīng)20~30min。

      10.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于所述步驟(2)中,檢測(cè)板的每個(gè)檢測(cè)孔分別裝填seq?no?383~569所示序列,其中鳥分枝桿菌復(fù)合群擴(kuò)增2個(gè)靶標(biāo)序列,與其互補(bǔ)的兩條sgrna,序列如seq?id?no.415、seq?id?no.416所示,裝填于同一檢測(cè)孔中;


      技術(shù)總結(jié)
      本發(fā)明公開一種多重PCR結(jié)合CRISPR?Cas快速檢測(cè)呼吸道病原體的試劑盒,包括多重?cái)U(kuò)增引物組合、sgRNA檢測(cè)板、DNA聚合酶、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶、CRISPR/Cas蛋白、熒光報(bào)告探針;多重?cái)U(kuò)增引物組合為SEQ?NO?1~374所示序列;sgRNA檢測(cè)板為陣列式微孔板,每個(gè)檢測(cè)孔分別裝填有SEQ?NO?383~569所示sgRNA中的一種。本發(fā)明的試劑盒可用于呼吸道病原體核酸檢測(cè),可同時(shí)檢測(cè)病毒和細(xì)菌,檢測(cè)通量高達(dá)178種病原體;本發(fā)明利用CRISPR?Cas對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物中的核酸片段靶點(diǎn)進(jìn)行特異性識(shí)別,進(jìn)行熒光檢測(cè),具有超多重、設(shè)備要求低,成本低、時(shí)間短、特異性高、靈敏度高等特點(diǎn),能為臨床上診斷病原體的感染提供分子水平的判斷依據(jù)和幫助。

      技術(shù)研發(fā)人員:付雪,段昆,徐丹,高曉慶,劉陸萍,韓序
      受保護(hù)的技術(shù)使用者:杭州杰毅生物技術(shù)有限公司
      技術(shù)研發(fā)日:
      技術(shù)公布日:2024/12/10
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