本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及肝臟ito細(xì)胞分離-凍存-復(fù)蘇的即用型體系構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肝臟是人體內(nèi)再生能力最強(qiáng)的器官之一，即使切除70-80%的肝臟，剩余的肝細(xì)胞仍然可以再生到原來(lái)的大小水平。目前認(rèn)為肝臟再生是通過(guò)生長(zhǎng)因子調(diào)控促肝細(xì)胞自身分裂增殖來(lái)實(shí)現(xiàn)，這一機(jī)理不僅揭示了肝臟自我修復(fù)的機(jī)理，而且在臨床上具有重要應(yīng)用價(jià)值，為相關(guān)疾病的治療和康復(fù)帶來(lái)了新的啟示。ito細(xì)胞屬于非實(shí)質(zhì)肝周細(xì)胞，又稱儲(chǔ)脂細(xì)胞，位于肝臟的disse內(nèi)皮下腔中，富含脂滴、其中儲(chǔ)存了人體80%以上的維生素a。正常肝臟中ito細(xì)胞富含大量脂滴，在肝臟中處于靜止?fàn)顟B(tài)，在生物體內(nèi)發(fā)揮功能主要是儲(chǔ)存維生素a和保護(hù)肝臟細(xì)胞。當(dāng)肝臟受損或受到外界刺激，ito細(xì)胞自動(dòng)被激活后開(kāi)始分化，此分化過(guò)程持續(xù)1-2周，最終分化為成纖維細(xì)胞，此期間通過(guò)調(diào)節(jié)一系列旁分泌機(jī)制促進(jìn)肝臟修復(fù)。例如：在肝臟受損時(shí)，ito細(xì)胞可分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，幫助肝臟形態(tài)恢復(fù)，而其中的維生素a亦能夠維持肝細(xì)胞的干性，增強(qiáng)肝細(xì)胞的自身分裂增殖能力；而在慢性肝病中，ito細(xì)胞活化過(guò)程中釋放炎癥趨化因子發(fā)揮促纖維化、促癌癥進(jìn)展等作用，這一特性在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要臨床意義。然而尚未見(jiàn)將大型哺乳動(dòng)物的肝臟ito細(xì)胞用于人體創(chuàng)面的再生修復(fù)，亦無(wú)大型哺乳動(dòng)物肝臟ito的分離方法。而分離后的原代細(xì)胞若直接應(yīng)用于創(chuàng)面，其流程制備周期較長(zhǎng)、環(huán)節(jié)復(fù)雜，因此很難滿足各類治療應(yīng)用場(chǎng)景，需要采用大規(guī)模細(xì)胞凍存的方式儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ欢Ｒ?guī)凍存

2、現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液待細(xì)胞復(fù)蘇后一般不適合直接用于養(yǎng)細(xì)胞，需要棄掉。主要原因是其包含的二甲基亞砜（dmso）等成分在細(xì)胞凍存過(guò)程中免受冷凍損傷、確保細(xì)胞在復(fù)蘇后能夠恢復(fù)其原有的生理功能和生物學(xué)特性。然而，當(dāng)細(xì)胞需要被培養(yǎng)時(shí)，它們需要的是一個(gè)能夠支持其分化和代謝的生長(zhǎng)環(huán)境，這通常包括適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、生長(zhǎng)因子、激素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這些在細(xì)胞凍存液中可能并不充足或并不完全適合細(xì)胞的培養(yǎng)需求。因此我們需要設(shè)計(jì)既能最大程度保持凍存細(xì)胞的活性，同時(shí)能夠滿足細(xì)胞短期生長(zhǎng)的要求，而且該凍存液中不含致敏原或者細(xì)胞毒作用的物質(zhì)，可直接用于皮膚創(chuàng)面，且能夠發(fā)揮協(xié)同促進(jìn)組織再生、加速創(chuàng)面愈合的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述背景技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題有3個(gè)：①設(shè)計(jì)出大型哺乳動(dòng)物肝臟ito細(xì)胞的無(wú)菌高效分離流程；②設(shè)計(jì)出能夠同時(shí)用于凍存和培養(yǎng)ito細(xì)胞的特殊凍存液，該凍存液能夠形成創(chuàng)面濕性愈合所需的基本條件，并能夠有效支持ito細(xì)胞在創(chuàng)面區(qū)域快速活化并釋放的大量生長(zhǎng)因子；③首次提出并采用肝臟ito細(xì)胞活化促進(jìn)各類創(chuàng)面的濕性愈合。

2、本發(fā)明提供肝臟ito細(xì)胞分離-凍存-復(fù)蘇的即用型體系構(gòu)建方法及應(yīng)用。將其應(yīng)用于創(chuàng)面愈合與毛發(fā)再生等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。通過(guò)優(yōu)化大型哺乳動(dòng)物肝臟ito細(xì)胞的無(wú)損高純分離與無(wú)致敏原的凝膠細(xì)胞凍存液研制，達(dá)到常規(guī)快速細(xì)胞復(fù)溫的操作即可獲得高活力ito細(xì)胞并直接用于創(chuàng)面治療，利用肝臟ito細(xì)胞在該凍存液中完成ito細(xì)胞快速活化和生長(zhǎng)因子的釋放，促進(jìn)各類創(chuàng)面修復(fù)與毛囊再生。本發(fā)明旨在提供一種對(duì)細(xì)胞無(wú)損害、分離效率高、可操作性強(qiáng)且成本較低的分離方法，及同時(shí)兼具細(xì)胞凍存和培養(yǎng)的即用型細(xì)胞凍存液，最后利用ito細(xì)胞自動(dòng)活化的特性提供促創(chuàng)面修復(fù)和毛發(fā)生長(zhǎng)的新型治療手段。

3、本發(fā)明第一個(gè)目的是提供一種肝臟ito細(xì)胞分離-凍存-復(fù)蘇的即用型體系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

4、從哺乳動(dòng)物肝臟中分離出高活力未激活ito細(xì)胞；

5、將ito細(xì)胞與即用型細(xì)胞凍存液充分混合，程序降溫，液氮儲(chǔ)存；

6、將凍存的ito細(xì)胞快速?gòu)?fù)溫至液態(tài)，即可得到富含高活力未激活的ito細(xì)胞懸液；

7、其中，所述細(xì)胞凍存液是按照以下步驟配制：

8、在無(wú)菌環(huán)境條件下，稱取一定量的高糖培養(yǎng)基、胰島素，加入無(wú)菌水定容至一定體積，配制為4x濃度混合液，為mix1溶液；

9、向4x濃度的mix1溶液加入等體積4x濃度丙二醇（8%），得到2x濃度的mix2溶液；

10、將2x濃度的mix2溶液和2x濃度的羧甲基纖維素鈉（3%）攪拌混合均勻，調(diào)節(jié)ph值為6.9~7.2，得到1x濃度的mix3溶液；

11、對(duì)1x濃度mix3溶液進(jìn)行無(wú)菌處理，并與肝臟基質(zhì)膠等體積混合，即得目標(biāo)細(xì)胞凍存液。

12、優(yōu)選的，所述ito細(xì)胞是按照以下步驟分離的：

13、在無(wú)菌環(huán)境中獲取保留肝門(mén)靜脈及下腔靜脈的哺乳動(dòng)物肝臟；

14、將哺乳動(dòng)物肝臟于無(wú)菌操作間進(jìn)行門(mén)靜脈插管，將預(yù)熱的生理鹽水進(jìn)行肝素灌流，持續(xù)灌流完全去除肝臟內(nèi)的紅細(xì)胞，直至肝臟呈現(xiàn)黃白色；

15、將去除紅細(xì)胞的肝臟于37℃，進(jìn)行酶消化液灌注至肝臟變軟無(wú)彈性，隨后于細(xì)胞分散液中進(jìn)行破碎，得到肝臟漿液；

16、將肝臟漿液于4℃持續(xù)灌洗細(xì)胞并過(guò)濾，收集過(guò)濾懸液；

17、將過(guò)濾懸液經(jīng)離心、重懸、定容，得到ito細(xì)胞。

18、優(yōu)選的，將細(xì)胞懸液經(jīng)離心、重懸、定容，包括：

19、將過(guò)濾懸液以500rpm/min離心10min，取下層細(xì)胞并用d-hanks溶液重懸，隨后以500rpm/min離心10min，取上清液，再以1750rpm/min離心10min，取下層沉積物用無(wú)血清dmem培養(yǎng)液重懸，并定容，獲得細(xì)胞懸液；

20、分別于50ml離心管底部加入60%的percoll，再加30%的percoll，最后加入細(xì)胞懸液，離心，所得體系中，30%的percoll上層為所得ito細(xì)胞；

21、所述30%或60%的percoll是將100ml?percoll中加10%氯化鈉10ml配成100%原液，使用0.9%生理鹽水配制成30%或60%目標(biāo)濃度，而制得。

22、優(yōu)選的，所述酶消化液是將iv型膠原酶、鏈酶蛋白酶e加入至d-hanks溶液中，混合均勻，調(diào)整ph值為7.3，過(guò)濾除菌而制得，其中，iv型膠原酶與鏈酶蛋白酶e的質(zhì)量比為1:2；

23、所述細(xì)胞分散液是將iv型膠原酶、鏈酶蛋白酶e?、dna酶i?，加入至d-hanks溶液中，混合均勻，過(guò)濾除菌而制得，其中，iv型膠原酶、鏈酶蛋白酶e?、dna酶i的質(zhì)量比為10：4：1。

24、優(yōu)選的，所述肝臟基質(zhì)膠是按照以下步驟制得：

25、將過(guò)濾懸液以500rpm/min離心10min，取上清液，經(jīng)過(guò)濾離心除去細(xì)胞碎片，通過(guò)濃縮獲得肝臟基質(zhì)膠，過(guò)濾除菌備用。

26、優(yōu)選的，配制目標(biāo)細(xì)胞凍存液時(shí)，所述高糖培養(yǎng)基、胰島素、羧甲基纖維素鈉以及肝臟基質(zhì)膠體積比為1:1:1:1；4x胰島素的濃度為0.04mg/ml。

27、優(yōu)選的，4x高糖培養(yǎng)基是由以下組分配制而得：

28、二水合氯化鈣1000~1100mg/l、l-絲氨酸160~170mg/l、九水合硝酸鐵0.3~0.5mg/l、l-蘇氨酸350~400mg/l、氯化鉀1500~2000mg/l、l-色氨酸50~80mg/l、無(wú)水硫酸鎂350~400mg/l、l-酪氨酸260~300mg/l、氯化鈉20000~30000mg/l、l-纈氨酸350~400mg/l、無(wú)水磷酸二氫鈉400~450mg/l、d-泛酸鈣12~18mg/l、丁二酸280~320mg/l、酒石酸膽堿25.5~30.3mg/l、丁二酸鈉380~410mg/l、葉酸13~18mg/l、l-鹽酸精氨酸310~350mg/l、肌醇26.6~30.3mg/l、l-鹽酸胱氨酸160~200mg/l、煙酰胺14~17mg/l、甘氨酸4500~5000mg/l、核黃素6.0~7.0mg/l、l-鹽酸組氨酸150~170mg/l、鹽酸硫胺12~20mg/l、l-異亮氨酸400~450mg/l、鹽酸吡哆辛12~18mg/l、l-亮氨酸400~450mg/l、葡萄糖3700~4200mg/l、l-鹽酸賴氨酸550~600mg/l、丙酮酸鈉400~450mg/l、l-甲硫氨酸100~150mg/l、l-苯丙氨酸240~280mg/l。

29、優(yōu)選的，4x濃度丙二醇，其濃度為4x母液濃度8%；2x羧甲基纖維素鈉母液濃度為3%，配制后的終濃度分別為2%和1.5%。

30、本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種含ito細(xì)胞凍存液。

31、本發(fā)明第三個(gè)目的是提供一種用肝臟ito細(xì)胞活化促進(jìn)各類創(chuàng)面的濕性愈合的全套流程方案。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

33、本發(fā)明提供了肝臟ito細(xì)胞分離-凍存-復(fù)蘇的即用型體系構(gòu)建方法及應(yīng)用，本發(fā)明利用富含高活性ito細(xì)胞的凍存液中直接置入創(chuàng)面局部，利用ito細(xì)胞在創(chuàng)面局部活化過(guò)程產(chǎn)生的各種促生長(zhǎng)因子實(shí)現(xiàn)促進(jìn)創(chuàng)面愈合與毛發(fā)再生的醫(yī)學(xué)功效，其中凍存液中所含的肝臟基質(zhì)成分和外源加入的羧甲基葡聚糖不僅發(fā)揮保護(hù)凍存ito的細(xì)胞活性的作用，還同時(shí)提供濕性環(huán)境促ito細(xì)胞活化并輔助創(chuàng)面愈合。該產(chǎn)品未來(lái)將用于人體大面積燒傷、切割傷、壓瘡、糖尿病足等各類急慢性等淺部和深部創(chuàng)面，同時(shí)對(duì)毛囊損傷引起的毛發(fā)生長(zhǎng)抑制有一定療效。