本發(fā)明涉及生物酶工程，具體涉及一種合成l-草銨膦的雙酶共表達重組載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、草銨膦(2-amino-4-hydroxymethylphosphinylbutanoic?acid，phosphinothricin)，化學(xué)名為2-氨基-4-?[羥基?(甲基)膦?；鵠丁酸銨，又名草丁膦，是一種高效廣譜、非傳導(dǎo)型的觸殺滅生性有機磷類除草劑。草銨膦的除草機理是通過抑制谷氨酰胺合成酶的活性進而抑制光合作用，并進一步引起植物體內(nèi)氨累積從而導(dǎo)致植物中毒死亡；同時，當(dāng)植物吸收草銨膦后，植物體內(nèi)以谷氨酸為前體的氨基酸合成受阻，阻斷了植物體內(nèi)氨基酸代謝。

2、目前市售的草銨膦，通常為l型和d型草銨膦的外消旋混合物，其中僅l-草銨膦具有除草活性，植物的莖葉能迅速吸收l-草銨膦，通過蒸騰作用在植物體內(nèi)進行傳導(dǎo)，發(fā)揮其除草活性，而l-草銨膦進入土壤后會被微生物降解而迅速失活；d-草銨膦對植物無毒性，但d-草銨膦的使用會增加農(nóng)民的生產(chǎn)成本和環(huán)境壓力，若使用l-草銨膦的純光學(xué)異構(gòu)體，能夠減少50%的草銨膦使用量，這對于推進農(nóng)業(yè)農(nóng)村綠色發(fā)展、建設(shè)美麗中國具有重要意義。草銨膦是全球三大除草劑之一，且近年來草銨膦在全球農(nóng)藥市場的比重逐年增加，因此實現(xiàn)環(huán)境友好型的工業(yè)化生產(chǎn)l-草銨膦已成為當(dāng)今農(nóng)藥生產(chǎn)的目標(biāo)。

3、生成光學(xué)純l-草銨膦的方法有：化學(xué)合成法和生物催化法；化學(xué)合成法中的手性輔助試劑誘導(dǎo)法需要在-78℃低溫反應(yīng)，工藝條件苛刻、所需試劑昂貴，且產(chǎn)率低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；天然氨基酸手性源法工藝中不僅需要用到價格昂貴的試劑，同時使用了劇毒試劑，易發(fā)生安全事故，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)；不對稱合成法中的?strecker?反應(yīng)和不對稱michael?加成法合成路線復(fù)雜、需要用到大量的催化劑，且副產(chǎn)物容易導(dǎo)致分離純化工藝復(fù)雜，大大增加了生產(chǎn)成本，且收率低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；外消旋體拆分法易造成原料浪費，增加了生產(chǎn)成本。同時化學(xué)合成過程中易產(chǎn)生大量“三廢”，工業(yè)三廢的處理成本不僅增加了生產(chǎn)成本，同時增加了環(huán)境壓力。

4、生物催化法具有反應(yīng)條件溫和、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點，逐漸成為近年來l-草銨膦合成法的研究熱點；傳統(tǒng)的生物催化包括：（1）催化水解?l-草銨膦前體合成?l-草銨膦，此方法中l(wèi)-草銨膦前體價格昂貴且不易得；（2）酶拆分外消旋混合物?d/l-草銨膦前體合成l-草銨膦，但該方法的理論收率僅為50%，會造成原料浪費。近年來發(fā)現(xiàn)了以草銨膦脫氫酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶去消旋合成l-草銨膦的方法，具體為d-草銨膦經(jīng)d-氨基酸氧化酶或ω-轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化生成ppo，ppo再經(jīng)草銨膦脫氫酶突變體或谷氨酸脫氫酶催化合成l-草銨膦，同時結(jié)合醇脫氫酶進行輔酶再生，但這兩種酶催化方法在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中存在酶利用效率低、l-草銨膦收率低等局限性。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、鑒于此，本發(fā)明提供了一種合成l-草銨膦的雙酶共表達重組載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，該重組載體中同時攜帶谷氨酸脫氫酶和nadp異丙醇脫氫酶的基因片段。含有該重組載體的菌株能夠高效發(fā)酵，培養(yǎng)一次的發(fā)酵液能夠同時得到表達量和活力相當(dāng)?shù)墓劝彼崦摎涿负蚽adp異丙醇脫氫酶，可用于以ppo為底物合成l-草銨膦的反應(yīng)及該反應(yīng)過程中nadph的循環(huán)再生，減少發(fā)酵次數(shù)。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種谷氨酸脫氫酶突變體，所述谷氨酸脫氫酶來源于坦氏不動桿菌（acinetobacter?tandoii）；所述谷氨酸脫氫酶突變體由ncbi基因序列庫中編號為wp_171284991.1的序列經(jīng)突變獲得，突變位點為i58a，a150g，g251q，v352a中的一個或多個。

4、優(yōu)選的，所述突變位點包含以下幾種：i58a，a150g，g251q，v352a，i58a/a150g，i58a/g251q，i58a/v352a，a150g/g251q，a150g/v352a，i58a/a150g/g251q，i58a/a150g/v352a，a150g/g251q/v352a，i58a/a150g/g251q/v352a。

5、優(yōu)選的，谷氨酸脫氫突變體由ncbi基因序列庫中編號為wp_171284991.1的氨基酸序列經(jīng)58位丙氨酸取代異亮氨酸、150位甘氨酸取丙氨酸、251位谷氨酰胺取代甘氨酸，352位丙氨酸取代纈氨酸得到，該谷氨酸脫氫酶突變體的堿基序列如seq?id?no.1所示，氨基酸序列seq?id?no.2。

6、一種共表達谷氨酸脫氫酶和nadp異丙醇脫氫酶的基因片段，包括谷氨酸脫氫酶突變體基因序列和nadp異丙醇脫氫酶基因序列；

7、其中，谷氨酸脫氫酶突變體的堿基序列如seq?id?no.1所示；

8、nadp異丙醇脫氫酶來源于嗜麥芽窄食單胞菌（stenotrophomonas?maltophilia），由ncbi基因序列庫中編號wp_088028380.1的氨基酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后得到，其堿基序列如seq?id?no.3所示，氨基酸序列如seq?id?no.4所示；

9、將seq?id?no.1所示的堿基序列和seq?id?no.3所示的堿基序列用1個rbs序列連接，得到共表達谷氨酸脫氫酶和nadp異丙醇脫氫酶的基因片段，該基因片段的堿基序列如seq?id?no.5所示。

10、一種含有seq?id?no.5所示基因片段的重組載體，該重組載體的堿基序列如seqid?no.6所示。

11、上述重組載體，構(gòu)建方法為：

12、將seq?id?no.1所示的堿基序列酶切連接于載體pet-28a(+)的酶切位點bamhⅰ和xhoⅰ兩酶切位點之間；

13、將seq?id?no.3所示的堿基序列酶切連接于載體pet-28a(+)的酶切位點ndeⅰ和hindⅲ之間；

14、seq?id?no.1所示的堿基序列和seq?id?no.3所示的堿基序列的n端同時攜帶his標(biāo)簽，可用于蛋白純化。

15、一種含有上述基因片段的雙酶共表達菌株的應(yīng)用，過程為：

16、（1）將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細胞得到合成l-草銨膦的雙酶共表達菌株；

17、（2）將雙酶共表達菌株的菌種按照1:100的接種比例接種于含100mg/l卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)4~6h至od600=2.0，得到種子液；

18、（3）將種子液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接至5l發(fā)酵罐進行高密度發(fā)酵，培養(yǎng)至od600=25~30時，加入iptg至終濃度0.1mmol/l，25℃誘導(dǎo)表達16h后于4℃、10000rpm離心15min，棄上清后收獲濕菌體；

19、（4）將濕菌體破碎后離心，得到含有谷氨酸脫氫酶和nadp異丙醇脫氫酶的粗酶液，該粗酶液能夠直接用于ppo轉(zhuǎn)化生成l-草銨膦。

20、優(yōu)選的，所述宿主細胞為大腸桿菌 e.coli?bl21(de3)。

21、優(yōu)選的，在應(yīng)用過程中，粗酶液以ppo為底物催化生成l-草銨膦時，ppo底物濃度≤50g/l，催化溫度為35℃，催化反應(yīng)在3h內(nèi)完成。

22、一種載酶樹脂，為所述粗酶液經(jīng)蛋白純化后得到，該載酶樹脂能夠重復(fù)利用。

23、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

24、1、與現(xiàn)有的nadp異丙醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶單獨表達菌株相比，本發(fā)明提供了一種能夠?qū)adp異丙醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶共表達的菌株，實現(xiàn)了一次菌株發(fā)酵即可同時得到兩種蛋白表達量基本一致的nadp異丙醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶，在催化ppo生產(chǎn)l-草銨膦的過程中，無需再加入醇脫氫酶進行輔酶nadph的循環(huán)再生，有效減少酶的使用量，在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中減少了工藝流程并降低了生產(chǎn)成本。

25、2、本發(fā)明提供了谷氨酸脫氫酶突變體的堿基序列和氨基酸序列，所表達的酶能夠高效催化ppo生成l-草銨膦，在100g/l的濃度下，催化時間3h底物轉(zhuǎn)化率可達95%。

26、3、本發(fā)明對nadp異丙醇脫氫酶進行密碼子優(yōu)化后，與谷氨酸脫氫酶突變體能夠同時進行蛋白純化，純化后的載酶樹脂中nadp異丙醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶的載酶量基本一致，可重復(fù)利用，滿足高濃度ppo催化合成l-草銨膦，減少了酶的發(fā)酵次數(shù)，顯著降低了生產(chǎn)成本。