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      一種合成L-草銨膦的雙酶共表達(dá)重組載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用與流程

      文檔序號:40389986發(fā)布日期:2024-12-20 12:13閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.?一種谷氨酸脫氫酶突變體,其特征在于,所述谷氨酸脫氫酶來源于坦氏不動(dòng)桿菌(acinetobacter?tandoii);所述谷氨酸脫氫酶突變體由ncbi基因序列庫中編號為wp_171284991.1的序列經(jīng)突變獲得,突變位點(diǎn)為i58a,a150g,g251q,v352a中的一個(gè)或多個(gè)。

      2.如權(quán)利要求1所述的谷氨酸脫氫酶突變體,其特征在于,所述突變位點(diǎn)包含以下幾種:i58a,a150g,g251q,v352a,i58a/a150g,i58a/g251q,i58a/v352a,a150g/g251q,a150g/v352a,i58a/a150g/g251q,i58a/a150g/v352a,a150g/g251q/v352a,i58a/a150g/g251q/v352a。

      3.?如權(quán)利要求2所述的谷氨酸脫氫酶突變體,其特征在于,谷氨酸脫氫突變體由ncbi基因序列庫中編號為wp_171284991.1的氨基酸序列經(jīng)58位丙氨酸取代異亮氨酸、150位甘氨酸取丙氨酸、251位谷氨酰胺取代甘氨酸,352位丙氨酸取代纈氨酸得到,該谷氨酸脫氫酶突變體的堿基序列如seq?id?no.1所示,氨基酸序列seq?id?no.2。

      4.一種共表達(dá)谷氨酸脫氫酶和nadp異丙醇脫氫酶的基因片段,其特征在于,包括權(quán)利要求3所述的谷氨酸脫氫酶突變體基因序列和nadp異丙醇脫氫酶基因序列;

      5.?一種含有seq?id?no.5所示基因片段的重組載體,其特征在于,該重組載體的堿基序列如seq?id?no.6所示。

      6.如權(quán)利要求5所述的重組載體,其特征在于,構(gòu)建方法為:

      7.一種含有權(quán)利要求5所述的重組載體的雙酶共表達(dá)菌株的應(yīng)用,其特征在于,過程為:

      8.?如權(quán)利要求7所述的雙酶共表達(dá)菌株的應(yīng)用,其特征在于,所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌e.coli?bl21(de3)。

      9.如權(quán)利要求7所述的雙酶共表達(dá)菌株的應(yīng)用,其特征在于,粗酶液以ppo為底物催化生成l-草銨膦時(shí),ppo底物濃度≤50g/l,催化溫度為35℃,催化反應(yīng)在3h內(nèi)完成。

      10.一種載酶樹脂,其特征在于,將權(quán)利要求7中的粗酶液經(jīng)蛋白純化后得到。


      技術(shù)總結(jié)
      本發(fā)明提供了一種合成L?草銨膦的雙酶共表達(dá)重組載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用,該重組載體中同時(shí)攜帶谷氨酸脫氫酶和NADP異丙醇脫氫酶;谷氨酸脫氫酶突變體的氨基酸序列是由NCBI基因序列庫中編號為WP_171284991.1的序列經(jīng)突變且谷氨酸脫氫酶活性不變;NADP異丙醇脫氫酶由NCBI基因序列庫中編號WP_088028380.1的氨基酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后得到;該菌株能夠高效發(fā)酵,培養(yǎng)一次的發(fā)酵液能夠同時(shí)得到表達(dá)量和活力相當(dāng)?shù)墓劝彼崦摎涿负蚇ADP異丙醇脫氫酶,可用于以PPO為底物合成L?草銨膦的反應(yīng)及該反應(yīng)過程中NADPH的循環(huán)再生,減少發(fā)酵次數(shù)。

      技術(shù)研發(fā)人員:劉永健,劉凱,潘榮,胡曉晉
      受保護(hù)的技術(shù)使用者:斯康芮生物醫(yī)藥(上海)有限公司
      技術(shù)研發(fā)日:
      技術(shù)公布日:2024/12/19
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