本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，涉及生物制品中宿主細(xì)胞殘留dna的檢測，具體為檢測e.coli細(xì)胞殘留dna含量、片段大小分布的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、生物制品的研究和生產(chǎn)所用的原材料多為細(xì)菌、病毒等微生物以及組織、細(xì)胞、體液等。原材料的內(nèi)在特性會產(chǎn)生潛在的危險性，因此，生物制品研發(fā)及生產(chǎn)過程中的生物安全問題備受人們的廣泛關(guān)注和世界各國的高度重視。此外，如果生物制品攜帶外源污染物，特別是可傳染的致病性微生物，生物制品可能成為傳播疫病的媒介，將嚴(yán)重威脅人類健康，因此各個國家都高度重視生物制品的安全性問題。

2、重組生物制品多由基因改造工程宿主細(xì)胞生產(chǎn)，在其產(chǎn)物中，同樣包含了大量的非目標(biāo)產(chǎn)物，這些產(chǎn)物來自于宿主細(xì)胞，對生物制品的安全性有著直接影響，尤其是宿主細(xì)胞殘留的dna是常見污染物，是生物制品質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。

3、在生產(chǎn)中，宿主細(xì)胞殘留dna(host?cell?residual?dna，hcd)是一種可能存在于最終的產(chǎn)品中的工藝相關(guān)雜質(zhì)，而hcd的含量與分布可能存在致瘤性和感染性等問題，受到了行業(yè)及法規(guī)機構(gòu)的關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明，hcd致病的功能基因至少需在200bp以上，因此殘留dna片段越大，風(fēng)險等級越高。目前對于很多基于宿主細(xì)胞培養(yǎng)的生物制品，都需要監(jiān)控hcd的片段分布及含量，如美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)和中國國家藥品監(jiān)督管理局(nmpa)均在基因治療新產(chǎn)品生產(chǎn)指導(dǎo)類型文件中明確指出hcd的片段要小于200bp。而生物重組制品中同樣存在hcd殘留的可能性，因此需要評估終產(chǎn)品中hcd片段的大小分布情況。

4、e.coli是基因工程的常見宿主菌，被廣泛用于生物制品的生產(chǎn)過程中，由于對其研究較為透徹，并且e.coli的培養(yǎng)所需條件溫和，門檻較低，新陳代謝迅速，因此具有明顯的經(jīng)濟優(yōu)勢。中國藥典2020年版三部規(guī)定以細(xì)胞基質(zhì)生產(chǎn)的生物制劑dna殘留量不能超過100pg/劑，以細(xì)菌或真菌基質(zhì)生產(chǎn)的疫苗dna殘留量不能超過10ng/劑。

5、對于生物制品中宿主細(xì)胞殘留dna的定量檢測，現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法包括：dna探針雜交法、熒光染料法、閾值法等，但由于檢測時間較長，不夠穩(wěn)定等原因，已不能滿足日益嚴(yán)苛的檢測需求，在部分國家已經(jīng)逐漸淘汰。

6、qpcr技術(shù)目前被廣泛用于生物制品檢測領(lǐng)域，在擴增過程中加入一種特異性熒光探針，通過熒光信號的變化反映產(chǎn)物的增加情況，從而能夠定量分析樣本中初始?xì)埩裟０辶?，由于taqman探針技術(shù)在準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性等方面的優(yōu)勢，其在基因定量、基因突變檢測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

7、在檢測殘留宿主細(xì)胞dna過程中，為了提高檢測的靈敏度，一般會選擇多拷貝序列作為檢測的靶標(biāo)，與動物細(xì)胞相比，大腸桿菌e.coli的基因組大小只有前者的千分之一，因此，對拷貝數(shù)的要求可以適當(dāng)降低?，F(xiàn)有技術(shù)中，國內(nèi)外學(xué)者普遍將細(xì)菌的16s?rdna和23srdna作為細(xì)菌分類和檢測的理想靶標(biāo)。此外，在qpcr擴增中大量使用的dna聚合酶一般都是e.coli重組酶，難免存在微量的e.coli基因組dna，也包括e.coli核糖體dna，這導(dǎo)致在qpcr的過程中存在陰性孔起跳。為了解決這個問題，本發(fā)明使用低e.coli宿主殘留dna的taq酶配置qpcr擴增體系，不僅保證了體系的高靈敏度，也減輕了原材料中e.coli宿主殘留dna對檢測過程的干擾。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、解決的技術(shù)問題：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，實現(xiàn)e.coli宿主菌殘留dna含量、片段大小的分布情況，進行精確定量并分析；鑒于此，本發(fā)明提供了檢測e.coli細(xì)胞殘留dna含量、片段大小分布的試劑盒及其應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：檢測e.coli細(xì)胞殘留dna含量、片段大小分布的試劑盒，所述試劑盒以e.coli細(xì)胞基因組dna為檢測靶標(biāo)，靶標(biāo)序列為seq?id?no.1；包括擴增seq?id?no.1序列的至少4套引物、探針組合。

3、優(yōu)選的，所述4套引物、探針組合的擴增產(chǎn)物長度分別為：100bp以下，100-199bp，200-499bp，500-600bp。

4、進一步的，所述探針5’端標(biāo)記有熒光報告基團，熒光報告基團優(yōu)選為fam，也可為其它具有相似功能的基團，3’端標(biāo)記有淬滅基團，淬滅基團優(yōu)選為bhq1，也可為其它具有相似功能的基團。

5、優(yōu)選的，所述4套引物、探針組合共用同一正向引物，序列為seq?id?no.2；反向引物序列分別為seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5和seq?id?no.6；所述4套引物、探針組合共用同一探針，序列為seq?id?no.7。

6、進一步的，第1套引物，正向引物結(jié)合于e.coli細(xì)胞基因組dna上seq?id?no.1序列的第884-904位；反向引物結(jié)合于e.coli細(xì)胞基因組dna上seq?id?no.1序列第956-975位，所述引物對擴增所獲得的擴增產(chǎn)物長度為93bp。第2套引物，正向引物結(jié)合于e.coli細(xì)胞基因組dna上seq?id?no.1序列的第884-904位；反向引物結(jié)合于e.coli細(xì)胞基因組dna上seqid?no.1序列的第1057-1077位，并且所述引物對擴增所獲得的擴增產(chǎn)物的長度為195

7、bp。第3套引物，正向引物結(jié)合于e.coli細(xì)胞基因組dna上seq?id?no.1序列的第884-904位；反向引物結(jié)合于e.coli細(xì)胞基因組dna上seq?id?no.1序列的第1088-1111位，并且所述引物對擴增所獲得的擴增產(chǎn)物的長度為228bp。第4套引物，正向引物結(jié)合于e.coli細(xì)胞基因組dna上seq?id?no.1序列的第884-904位；反向引物結(jié)合于e.coli細(xì)胞基因組dna上seq?id?no.1序列的第1371-1392位，并且所述引物對擴增所獲得的擴增產(chǎn)物的長度為510bp。探針序列seq?id?no.7結(jié)合于e.coli細(xì)胞基因組dna上seq?id?no.1所示序列的第905-936位。

8、其中，第1套引物，正向引物和反向引物的tm值為60.41-60.68℃，tm的差值的絕對值≤1℃。第2套引物，正向引物和反向引物的tm值為59.3-60.41℃，tm的差值的絕對值≤1℃。第3套引物，正向引物和反向引物的tm值為60.41-60.68℃，tm的差值的絕對值≤1℃。第4套引物，正向引物和反向引物的tm值為60.41-59.3℃，tm的差值的絕對值≤1℃。

9、優(yōu)選的，所述4套引物、探針組合在擴增體系中的使用終濃度分別為：

10、第1套引物、探針組合，seq?id?no.2和seq?id?no.3的終濃度為0.24μm，seq?idno.7的終濃度為0.12μm；

11、第2套引物、探針組合，seq?id?no.2和seq?id?no.4的終濃度為0.267μm，seq?idno.7的終濃度為0.133μm；

12、第3套引物、探針組合，seq?id?no.2和seq?id?no.5的終濃度為0.267μm，seq?idno.7的終濃度為0.133μm；

13、第4套引物、探針組合，seq?id?no.2和seq?id?no.6的終濃度為0.293μm，seq?idno.7的終濃度為0.147μm。

14、優(yōu)選的，所述試劑盒包括ipc?mix，且分別添加至每套引物、探針組合中；所述ipcmix包括ipc模板質(zhì)粒和ipc引物探針組合，其中ipc模板質(zhì)粒為人工改造的克隆質(zhì)粒，序列為seq?id?no.8，ipc正向引物序列為seq?id?no.9，ipc反向引物序列為seq?id?no.10，ipc探針序列為seq?id?no.11。

15、優(yōu)選的，所述ipc模板質(zhì)粒和ipc引物探針組合在擴增體系中的使用終濃度分別為：

16、seq?id?no.8的終濃度為2.48×105copies/ml；seq?id?no.9和seq?id?no.10的終濃度為0.3μm；seq?id?no.11的終濃度為0.106μm。

17、優(yōu)選的，所述試劑盒包括2×qpcr?mix、e.coli定量標(biāo)準(zhǔn)品和dna稀釋液；其中，2×qpcr?mix包括40mm?tris-hcl?ph?7.8、0.1u/μl?taq酶、0.6mm?dntps、100nm?rox參比染料、8mm?mg2+、20％甘油。e.coli定量標(biāo)準(zhǔn)品為e.coli細(xì)胞基因組dna，濃度為30ng/μl。dna稀釋液包括tween-20濃度為0.1-0.2％，tris-hcl濃度為5.0-10.0mm，edta的濃度為0.05-0.1mm，用naoh溶液調(diào)節(jié)ph為6.0-8.5。

18、以上任一所述試劑盒在定量檢測生物制品的中間品、半成品和成品中e.coli細(xì)胞dna含量、片段大小分布中的應(yīng)用。

19、優(yōu)選的，所述生物制品是采用e.coli細(xì)胞表達系統(tǒng)生產(chǎn)獲得，包括：抗體藥物、疫苗和重組蛋白。

20、優(yōu)選的，所述試劑盒能夠準(zhǔn)確區(qū)分生物制品中e.coli細(xì)胞dna片段大小為100bp以下、100-199bp、200-499bp、500-600bp的序列，且各檢測體系定量限均達10fg/μl。

21、有益效果：(1)本發(fā)明所述試劑盒經(jīng)過對檢測靶標(biāo)的篩選分析、引物探針設(shè)計及檢測體系優(yōu)化，建立了能夠同時定量檢測e.coli宿主菌及各片段大小分布的qpcr檢測方法，為生物制品生產(chǎn)廠家提供便利，提高產(chǎn)品質(zhì)控效率；(2)所述試劑盒的應(yīng)用能將產(chǎn)品檢測時間控制在4小時內(nèi)，靈敏度高且定量限達10fg/μl，專屬性強；(3)所述試劑盒能夠區(qū)分cho細(xì)胞、vero細(xì)胞、hek293細(xì)胞、畢赤酵母細(xì)胞等干擾性dna。