本發(fā)明屬于基因工程，涉及一種提高酵母菌中乙醇到乙酰輔酶a轉化率的方法、工程菌及在生產(chǎn)3-羥基丙酸中的應用。

背景技術：

1、工程菌株在放大生產(chǎn)過程中生產(chǎn)性能的不穩(wěn)定性一直是阻礙工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的關鍵性問題。為了實現(xiàn)目標產(chǎn)物的過量生產(chǎn)，通常需要在工程菌中人工引入外源代謝途徑和強化相關的內(nèi)源代謝途徑。然而，這些改造不可避免地對細胞造成生長和代謝上的壓力。而在工業(yè)放大生產(chǎn)過程中，細胞傾向于通過各種代謝相互作用，限制過量生產(chǎn)目標產(chǎn)物的能力，用以緩解代謝壓力，促進細胞生長，進而導致生產(chǎn)性狀的弱化或丟失。

2、細胞工廠設計中的正交化是指通過工程改造，使某一個特定分子或基因線路的功能不受細胞內(nèi)環(huán)境的多余影響且不對環(huán)境施加多余影響。正交化改造可以使生產(chǎn)的代謝途徑與細胞底盤代謝之間的相互作用節(jié)點降到最少，從而使生產(chǎn)途徑作為一個相對獨立模塊，使其受到細胞正常生長代謝的干擾降到最小，從而保持生產(chǎn)性能的穩(wěn)定性。此外，通過正交化改造，也可以減少底物到前體的旁路代謝，從而可以實現(xiàn)轉化率的最大化。

3、3-羥基丙酸(3-hp)是一種高附加值化學品，在醫(yī)療、個人護理、涂料、膠黏劑、紡織、食品、飼料等領域具有巨大的應用價值。隨著工業(yè)化進程加快，3-hp市場需求正日益增加，據(jù)估計，2025年，全球3-羥基丙酸的市場需求量將達100億美元。合成技術是制約3-hp規(guī)?；瘧玫闹匾蛩兀?-hp合成技術包括化學合成法、生物合成法兩大類，其中化學合成法是目前主流生產(chǎn)工藝，但化學合成法存在工藝復雜、污染嚴重等問題。近年來，基于工程微生物的3-hp合成技術成為國內(nèi)外高?？蒲嘘P注的焦點，但利用生物合成法生產(chǎn)3-hp依然存在菌株生產(chǎn)效率低，穩(wěn)定性差等問題。

4、綜上所述，如何開發(fā)高效、穩(wěn)定的工程菌株仍是3-hp生物合成領域亟需解決的問題之一。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術的不足和實際需求，本發(fā)明提供一種提高酵母菌中乙醇到乙酰輔酶a轉化率的方法、工程菌及其在生產(chǎn)3-羥基丙酸中的應用，以期獲得高效、穩(wěn)定生產(chǎn)3-hp的工程菌株。

2、為達此目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種利用葡萄糖和乙醇雙碳源穩(wěn)定生產(chǎn)3-羥基丙酸的酵母工程菌，所述工程菌缺失pfk1和pfk2基因；所述工程菌還過表達mutacc1、mcrc、mcrn、zwf1、gnd1、tal1、rki1、rpe1、tkl1和以及融合的cagapdh和pos5基因。

4、本發(fā)明中，基于代謝途徑正交化策略，設計提高酵母細胞中乙醇到乙酰輔酶a及其下游代謝產(chǎn)物轉化效率的菌株改造方法，構建生產(chǎn)3-hp的工程酵母菌株，實現(xiàn)了3-hp在酵母中的穩(wěn)定合成，為生物法生產(chǎn)3-hp提供新思路。

5、優(yōu)選地，所述工程菌還缺失cit2和icl1基因。

6、優(yōu)選地，所述工程菌還過表達ada基因。

7、優(yōu)選地，所述工程菌還缺失ald2、ald3、ald4、ald5和ald6基因。

8、優(yōu)選地，所述工程菌還缺失acs1、acs2和ach1基因。

9、優(yōu)選地，所述工程菌還缺失yat1、yat2、crc1和cat2基因。

10、本發(fā)明中，基于構建的穩(wěn)定合成3-hp的工程菌，進一步進行乙醇到3-hp高效轉化途徑的改造，包括以下至少一種：(1)敲除cit2和icl1基因；(2)過表達ada基因；(3)敲除ald2、ald3、ald4、ald5和ald6基因；(4)敲除acs1、acs2和ach1基因；(5)敲除yat1和yat2、crc1和cat2基因；均能夠進一步提高3-hp的產(chǎn)量。

11、優(yōu)選地，所述工程菌的出發(fā)菌株包括釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)。

12、可以理解，本發(fā)明基于釀酒酵母對乙醇到乙酰輔酶a的代謝途徑進行系統(tǒng)梳理和改造，具有相似基因組和代謝網(wǎng)絡的酵母菌種理論上均適用于本發(fā)明，可選地，包括釀酒酵母imx581等等。

13、可選地，mutacc1基因核酸序列如seq?id?no.1所示，mcrc基因核酸序列如seq?idno.2所示，mcrn基因核酸序列如seq?id?no.3所示，cagapdh基因核酸序列如seq?id?no.4所示，ada基因核酸序列如seq?id?no.5所示。

14、seq?id?no.1(mutacc1)：

15、atgagcgaagaaagcttattcgagtcttctccacagaagatggagtacgaaattacaaactactcagaaagacatacagaacttccaggtcatttcattggcctcaatacagtagataaactagaggagtccccgttaagggactttgttaagagtcacggtggtcacacggtcatatccaagatcctgatagcaaataatggtattgccgccgtgaaagaaattagatccgtcagaaaatgggcatacgagacgttcggcgatgacagaaccgtccaattcgtcgccatggccaccccagaagatctggaggccaacgcagaatatatccgtatggccgatcaatacattgaagtgccaggtggtactaataataacaactacgctaacgtagacttgatcgtagacatcgccgaaagagcagacgtagacgccgtatgggctggctggggtcacgcctccgagaatccactattgcctgaaaaattgtcccagtctaagaggaaagtcatctttattgggcctccaggtaacgccatgaggtctttaggtgataaaatctcctctaccattgtcgctcaaagtgctaaagtcccatgtattccatggtctggtaccggtgttgacaccgttcacgtggacgagaaaaccggtctggtctctgtcgacgatgacatctatcaaaagggttgttgtacctctcctgaagatggtttacaaaaggccaagcgtattggttttcctgtcatgattaaggcatccgaaggtggtggtggtaaaggtatcagacaagttgaacgtgaagaagatttcatcgctttataccaccaggcagccaacgaaattccaggctcccccattttcatcatgaagttggccggtagagcgcgtcacttggaagttcaactgctagcagatcagtacggtacaaatatttccttgttcggtagagactgttccgttcagagacgtcatcaaaaaattatcgaagaagcaccagttacaattgccaaggctgaaacatttcacgagatggaaaaggctgccgtcagactggggaaactagtcggttatgtctctgccggtaccgtggagtatctatattctcatgatgatggaaaattctactttttagaattgaacccaagattacaagtcgagcatccaacaacggaaatggtctccggtgttaacttacctgcagctcaattacaaatcgctatgggtatccctatgcatagaataagtgacattagaactttatatggtatgaatcctcattctgcctcagaaatcgatttcgaattcaaaactcaagatgccaccaagaaacaaagaagacctattccaaagggtcattgtaccgcttgtcgtatcacatcagaagatccaaacgatggattcaagccatcgggtggtactttgcatgaactaaacttccgttcttcctctaatgtttggggttacttctccgtgggtaacaatggtaatattcactccttttcggactctcagttcggccatatttttgcttttggtgaaaatagacaagcttccaggaaacacatggttgttgccctgaaggaattgtccattaggggtgatttcagaactactgtggaatacttgatcaaacttttggaaactgaagatttcgaggataacactattaccaccggttggttggacgatttgattactcataaaatgaccgctgaaaagcctgatccaactcttgccgtcatttgcggtgccgctacaaaggctttcttagcatctgaagaagcccgccacaagtatatcgaatccttacaaaagggacaagttctatctaaagacctactgcaaactatgttccctgtagattttatccatgagggtaaaagatacaagttcaccgtagctaaatccggtaatgaccgttacacattatttatcaatggttctaaatgtgatatcatactgcgtcaactagctgatggtggtcttttgattgccataggcggtaaatcgcataccatctattggaaagaagaagttgctgctacaagattatccgttgactctatgactactttgttggaagttgaaaacgatccaacccagttgcgtactccatcccctggtaaattggttaaattcttggtggaaaatggtgaacacattatcaagggccaaccatatgcagaaattgaagttatgaaaatgcaaatgcctttggtttctcaagaaaatggtatcgtccagttattaaagcaacctggttctaccattgttgcaggtgatatcatggctattatgactcttgacgatccatccaaggtcaagcacgctctaccatttgaaggtatgctgccagattttggttctccagttatcgaaggaaccaaacctgcctataaattcaagtcattagtgtctactttggaaaacattttgaagggttatgacaaccaagttattatgaacgcttccttgcaacaattgatagaggttttgagaaatccaaaactgccttactcagaatggaaactacacatctctgctttacattcaagattgcctgctaagctagatgaacaaatggaagagttagttgcacgttctttgagacgtggtgctgttttcccagctagacaattaagtaaattgattgatatggccgtgaagaatcctgaatacaaccccgacaaattgctgggcgccgtcgtggaaccattggcggatattgctcataagtactctaacgggttagaagcccatgaacattctatatttgtccatttcttggaagaatattacgaagttgaaaagttattcaatggtccaaatgttcgtgaggaaaatatcattctgaaattgcgtgatgaaaaccctaaagatctagataaagttgcgctaactgttttgtctcattcgaaagtttcagcgaagaataacctgatcctagctatcttgaaacattatcaaccattgtgcaagttatcttctaaagtttctgccattttctctactcctctacaacatattgttgaactagaatctaaggctaccgctaaggtcgctctacaagcaagagaaattttgattcaaggcgctttaccttcggtcaaggaaagaactgaacaaattgaacatatcttaaaatcctctgttgtgaaggttgcctatggctcatccaatccaaagcgctctgaaccagatttgaatatcttgaaggacttgatcgattctaattacgttgtgttcgatgttttacttcaattcctaacccatcaagacccagttgtgactgctgcagctgctcaagtctatattcgtcgtgcttatcgtgcttacaccataggagatattagagttcacgaaggtgtcacagttccaattgttgaatggaaattccaactaccttcagctgcgttctccacctttccaactgttaaatctaaaatgggtatgaacagggctgttgctgtttcagatttgtcatatgttgcaaacagtcagtcatctccgttaagagaaggtattttgatggctgtggatcatttagatgatgttgatgaaattttgtcacaaagtttggaagttattcctcgtcaccaatcttcttctaacggacctgctcctgatcgttctggtagctccgcatcgttgagtaatgttgctaatgtttgtgttgcttctacagaaggtttcgaatctgaagaggaaattttggtaaggttgagagaaattttggatttgaataagcaggaattaatcaatgcttctatccgtcgtatcacatttatgttcggttttaaagatgggtcttatccaaagtattatacttttaacggtccaaattataacgaaaatgaaacaattcgtcacattgagccggctttggccttccaactggaattaggaagattgtccaacttcaacattaaaccaattttcactgataatagaaacatccatgtctacgaagctgttagtaagacttctccattggataagagattctttacaagaggtattattagaacgggtcatatccgtgatgacatttctattcaagaatatctgacttctgaagctaacagattgatgagtgatatattggataatttagaagtcaccgacacttcaaattctgatttgaatcatatcttcatcaacttcattgcggtgtttgatatctctccagaagatgtcgaagccgccttcggtggtttcttagaaagatttggtaagagattgttgagattgcgtgtttcttctgccgaaattagaatcatcatcaaagatcctcaaacaggtgccccagtaccattgcgtgccttgatcaataacgtttctggttatgttatcaaaacagaaatgtacaccgaagtcaagaacgcaaaaggtgaatgggtatttaagtctttgggtaaacctggatccatgcatttaagacctattgctactccttaccctgttaaggaatggttgcaaccaaaacgttataaggcacacttgatgggtaccacatatgtctatgacttcccagaattattccgccaagcatcgtcatcccaatggaaaaatttctctgcagatgttaagttaacagatgatttctttatttccaacgagttgattgaagatgaaaacggcgaattaactgaggtggaaagagaacctggtgccaacgctattggtatggttgcctttaagattactgtaaagactcctgaatatccaagaggccgtcaatttgttgttgttgctaacgatatcacattcaagatcggttcctttggtccacaagaagacgaattcttcaataaggttactgaatatgctagaaagcgtggtatcccaagaatttacttggctgcaaactcaggtgccagaattggtatggctgaagagattgttccactatttcaagttgcatggaatgatgctgccaatccggacaagggcttccaatacttatacttaacaagtgaaggtatggaaactttaaagaaatttgacaaagaaaattctgttctcactgaacgtactgttataaacggtgaagaaagatttgtcatcaagacaattattggttctgaagatgggttaggtgtcgaatgtctacgtggatctggtttaattgctggtgcaacgtcaagggcttaccacgatatcttcactatcaccttagtcacttgtagatccgtcggtatcggtgcttatttggttcgtttgggtcaaagagctattcaggtcgaaggccagccaattattttaactggtgctcctgcaatcaacaaaatgctgggtagagaagtttatacttctaacttacaattgggtggtactcaaatcatgtataacaacggtgtttcacatttgactgctgttgacgatttagctggtgtagagaagattgttgaatggatgtcttatgttccagccaagcgtaatatgccagttcctatcttggaaactaaagacacatgggatagaccagttgatttcactccaactaatgatgaaacttacgatgtaagatggatgattgaaggtcgtgagactgaaagtggatttgaatatggtttgtttgataaagggtctttctttgaaactttgtcaggatgggccaaaggtgttgtcgttggtagagcccgtcttggtggtattccactgggtgttattggtgttgaaacaagaactgtcgagaacttgattcctgctgatccagctaatccaaatagtgctgaaacattaattcaagaacctggtcaagtttggcatccaaactccgccttcaagactgctcaagctatcaatgactttaacaacggtgaacaattgccaatgatgattttggccaactggagaggtttctctggtggtcaacgtgatatgttcaacgaagtcttgaagtatggttcgtttattgttgacgcattggtggattacaaacaaccaattattatctatatcccacctaccggtgaactaagaggtggttcatgggttgttgtcgatccaactatcaacgctgaccaaatggaaatgtatgccgacgtcaacgctagagctggtgttttggaaccacaaggtatggttggtatcaagttccgtagagaaaaattgctggacaccatgaacagattggatgacaagtacagagaattgagatctcaattatccaacaagagtttggctccagaagtacatcagcaaatatccaagcaattagctgatcgtgagagagaactattgccaatttacggacaaatcagtcttcaatttgctgatttgcacgataggtcttcacgtatggtggccaagggtgttatttctaaggaactggaatggaccgaggcacgtcgtttcttcttctggagattgagaagaagattgaacgaagaatatttgattaaaaggttgagccatcaggtaggcgaagcatcaagattagaaaagatcgcaagaattagatcgtggtaccctgcttcagtggaccatgaagatgataggcaagtcgcaacatggattgaagaaaactacaaaactttggacgataaactaaagggtttgaaattagagtcattcgctcaagacttagctaaaaagatcagaagcgaccatgacaatgctattgatggattatctgaagttatcaagatgttatctaccgatgataaagaaaaattgttgaagactttgaaataa。

16、seq?id?no.2：(mcrc)

17、atgtccgctaccactggtgctagatctgcatcagttggttgggctgaaagtttgatcggtttgcatttgggtaaagtcgcattgatcacaggtggttccgccggtatcggtggtcaaattggtagattgttagcattaagtggtgccagagttatgttggcagccagagatagacataagttagaacaaatgcaagctatgattcaatcagaattggcagaagttggttacactgatgttgaagacagagtccacatagctccaggttgcgatgtctcttcagaagcccaattggctgacttagtagaaagaactttgtctgctttcggtacagttgattatttgattaataacgcaggtatagccggtgtagaagaaatggttatagatatgcctgttgaaggttggagacatacattgttcgcaaatttgatctccaactacagtttgatgagaaagttggctccattaatgaaaaagcaaggttccggttacatattgaacgtttccagttacttcggtggtgaaaaagatgctgcaataccatatcctaacagagctgactacgcagtctctaaggcaggtcaaagagcaatggccgaagtatttgctagattcttaggtcctgaaatccaaattaatgctattgcaccaggtcctgttgaaggtgacagattaagaggtactggtgaaagaccaggtttgtttgccagaagagctagattgatcttggaaaataagagattgaacgaattacatgccgctttgattgcagccgctagaacagatgaaagatctatgcacgaattagtagaattgttgttgcctaatgacgttgcagccttggaacaaaaccctgctgcaccaactgccttgagagaattagctagaagattcagatctgaaggtgacccagccgcttcttcatccagtgcattgttgaacagatcaatagcagccaagttattggctagattacataacggtggttatgttttgcctgctgatatttttgcaaatttgcctaacccacctgacccatttttcacaagagcccaaattgatagagaagctagaaaggttagagacggtatcatgggcatgttgtacttgcaaagaatgccaaccgaatttgatgttgccatggctactgtctattacttagctgacagaaatgttgtttccggtgaaacttttcatcctagtggtggtttgagatatgaaagaactccaacaggtggtgaattgttcggtttaccatctcctgaaagattggctgaattagtcggttcaacagtatacttaataggtgaacatttgaccgaacacttaaatttgttggcaagagcctatttggaaagatacggtgcaagacaagttgtcatgattgttgaaaccgaaactggtgctgaaacaatgagaagattattgcatgatcacgttgaagctggtagattgatgaccattgttgctggtgaccaaatagaagctgcaatcgaccaagctattactagatatggtagaccaggtcctgtagtttgtactccttttagaccattacctacagttccattggtcggtagaaaagattctgactggtcaacagttttatcagaagcagaatttgccgaattatgcgaacatcaattgactcatcacttcagagtcgccagaaagtggattgctttgtctgatggtgcttcacgattagcattggtaaccccagaaacaaccgctacttccactacagaacaattcgctttggcaaacttcatcaagaccactttgcatgccttcacagctaccattggtgtagaaagtgaaagaactgctcaaagaatattaatcaaccaagttgatttgacaagaagagccagagctgaagaacctagagacccacacgaaagacaacaagaattagaaagattcattgaagcagtattgttggttactgccccattgccaccagaagcagacacaagatacgcaggtagaatccacagaggtagagccattacagtctaa。

18、seq?id?no.3：(mcrn)

19、atgagtggtacaggtagattagcaggtaaaatagcattgataacaggtggtgccggtaacataggttccgaattaacaagaagatttttggcagaaggtgccaccgttattatctctggtagaaacagagcaaagttaactgccttggctgaaagaatgcaagcagaagccggtgtccctgctaagagaattgatttggaagttatggatggttctgacccagtcgctgtaagagcaggtattgaagccatagtagctagacatggtcaaatcgatatcttggttaacaacgcaggttcagctggtgcacaaagaagattggctgaaattcctttaactgaagcagaattgggtccaggtgccgaagaaacattacatgcatccattgccaatttgttgggtatgggttggcatttgatgagaatagctgcaccacacatgcctgttggtagtgcagttataaacgtctccaccatcttcagtagagctgaatattacggtagaattccttatgttactccaaaagccgctttaaatgcattgtctcaattagcagccagagaattaggtgctagaggtattagagttaacaccatatttccaggtcctatcgaatcagatagaattagaactgtcttccaaagaatggatcaattaaagggtagacctgaaggtgacacagctcatcactttttaaacaccatgagattgtgtagagcaaacgatcaaggtgccttggaaagaagatttccatctgtaggtgacgttgctgacgctgcagtcttcttagcctccgctgaaagtgccgctttgtcaggtgaaactattgaagttacacatggtatggaattgccagcctgctctgaaacatcattgttagcaagaaccgatttgagaactattgacgcttctggtagaactacattgatctgtgctggtgaccaaattgaagaagtcatggctttgacaggcatgttaagaacctgcggttctgaagtaatcattggttttagatcagcagccgctttagctcaattcgaacaagcagttaatgaatcaagaagattggcaggtgccgattttacaccacctatagctttaccattagatccaagagatccagcaaccatcgatgccgtattcgactggggtgctggtgaaaatacaggtggtatacatgcagccgttatcttaccagctacctctcacgaaccagcaccttgtgtcatagaagtagatgacgaaagagttttgaacttcttagctgatgaaatcacaggtaccattgtcatagcttccagattagcaagatattggcaaagtcaaagattgactcctggtgctagagcaagaggtccaagagtaatctttttgtctaatggtgctgatcaaaacggtaacgtttacggtagaattcaatcagctgcaataggtcaattaatcagagtttggagacatgaagctgaattggattaccaaagagcatctgccgctggtgaccacgtcttaccacctgtatgggccaatcaaattgttagatttgctaacagatccttggaaggtttagaattcgcctgtgcttggactgctcaattgttgcatagtcaaagacacatcaacgaaatcacattgaacataccagccaacatctaa。

20、seq?id?no.4：(cagapdh)

21、atggctaagattgctattaacggtttcggtagaattggtagattggccttgcgtagaatcttggaagtcccaggtttggaagttgttgctattaacgatttgactgatgctaagatgttggctcacttgtttaaatacgattcctctcaaggtagattcaacggtgaaattgaagttaaagaaggtgctttcgttgttaatggaaaggaagttaaggttttcgctgaagctgatccagaaaagttgccatggggtgacttgggtatcgatgttgttttggaatgtactggtttcttcactaagaaggaaaaagctgaagcccacgttagagctggtgctaagaaggttgttatttctgctccagctggtaatgatttgaaaactattgtttttaatgttaataatgaagatttggacggtactgaaaccgttatctctggtgcttcttgtactactaactgtttggctccaatggctaaggttttgaatgataagtttggtattgaaaagggttttatgactactattcacgctttcaccaacgatcaaaatactttggacggtccacatagaaagggtgacttgagaagagctagagctgctgctgtttcaattattccaaactccactggtgctgctaaggctatttctcaagttattcctgacttggctggtaaattggatggtaacgctcaaagagttccagttccaactggttctattactgaactagtctctgttttgaagaagaaagttaccgttgaagaaattaacgccgctatgaaagaagctgctgacgaatcttttggttatactgaagatccaattgtttctgctgatgttgttggtattaattacggttctttgtttgatgctactttgaccaaaattgttgatgttaatggttcccaattagttaagactgctgcttggtatgataacgaaatgtcttatacttcccaattggttagaaccttggcttacttcgctaagattgctaagtaa。

22、seq?id?no.5：(ada)

23、atggaacactccgttattgaaccaactgttccaatgccgatgccagccatgttcgatgctccatccggtatctttgattctttggacgatgccgtccaagctgctgtctacgcccaacaacaattgaactctgtcgaattgagacaacaagttatcaaggctatccgtgttgctggtgaaagatacgctcaagtcttggctgaaatggctgttgccgaaaccggtatgggtagagttgtcgacaagtacattaagaacgtatctcaagctcgtcatacaccaggtatcgaatgtttgtccgctgaagttttgactggtgacaacggtttgactttgattgaaaatgctccatggggtgtcgttgcttccgtcactccatctactaaccctgctgccaccgtcatcaacaacgctatctccatgattgctgccggaaatagtgtcgtttttgccccacatccatctgctaagaacgtttccttgagaaccattagcttattaaacaaggccattgttgctactggtggtccagaaaacctattagtctcagtctccgacccaaacatagaaaccgctcaaagattgttccgttacccaggtattggtttgttggttgttactggtggtgaggctgtcgttgaagctgcaagaaagcacactgacaagagattgatcgctgctggtgctggtaaccctccagtcgttgttgatgaaactgctgatattcctaaggctgcaagagctattgtcaagggtgcttctttcgacaacaacatcatctgtgctgacgaaaaggttctaatcgtggtcgattctgtcgctgacgctttgttggaagaaatgcaaagaaaccacgctgttttgttaactccagctcaaactgaacaactattgccagctttgttgtctgacattgacgaacaaggtaagggtagagttaacagagactacgttggtcgtgatgctaccaagttggccgaagccatcggtttggaagtcaacgaatataccagattgttgttagctgaaaccgatgcctctcacccattcgctgtcaccgaattgatgatgccagtcctgccagttgttagagttaagaacgtcgatgaagctatcgccttggctttgaaattggaaaatggttgtagacacaccgctgctatgcactctaccaacattagaaacttgaacagaatggctaacgccattaacacttctatcttcgttaaaaatggtccatgcattgctggcttgggtttaggtggtgaaggttggacttccatgactatctctaccccaaccggcgaaggtgttacctctgccagaactttcgtcagattaagaagatgtgttttggtagacatgttcagaatcgcctga。

24、第二方面，本發(fā)明提供一種制備第一方面所述的利用葡萄糖和乙醇雙碳源穩(wěn)定生產(chǎn)3-羥基丙酸的酵母工程菌的方法，所述方法包括：

25、以酵母菌為出發(fā)菌株，敲除pfk1和pfk2基因，并過表達mutacc1、mcrc、mcrn、zwf1、gnd1、tal1、rki1、rpe1、tkl1以及融合的cagapdh和pos5基因。

26、可以理解，基于本發(fā)明設計的改造策略，本領域通用的基因敲除或過表達方法均適用于本發(fā)明。

27、第三方面，本發(fā)明提供第一方面所述的利用葡萄糖和乙醇雙碳源穩(wěn)定生產(chǎn)3-羥基丙酸的酵母工程菌在生產(chǎn)3-hp中的應用。

28、第四方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)3-hp的方法，所述方法包括：

29、培養(yǎng)第一方面所述的利用葡萄糖和乙醇雙碳源穩(wěn)定生產(chǎn)3-hp的酵母工程菌，收集菌液進行產(chǎn)物分離純化，得到所述3-hp。

30、基于本發(fā)明構建的工程菌，采用本領域通用的培養(yǎng)和純化方法，即可實現(xiàn)高效生產(chǎn)3-hp。

31、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

32、本發(fā)明通過在釀酒酵母內(nèi)對乙醇到乙酰輔酶a的代謝途徑進行系統(tǒng)梳理和改造，有效提高了乙醇到3-hp的轉化率，并通過適應性實驗室進化重塑細胞內(nèi)的還原力和能量平衡，實現(xiàn)了3-hp在釀酒酵母中的穩(wěn)定合成。此外，本發(fā)明通過重塑酵母中樞代謝，為利用合成生物學手段高效轉化低碳化合物提供了新的思路。