本技術(shù)總體上涉及生物，具體而言，本技術(shù)涉及富集自然殺傷細(xì)胞的全封閉方法及系統(tǒng)等。

背景技術(shù)：

1、自然殺傷(nk)細(xì)胞作為一種具有直接殺傷惡性細(xì)胞能力的天然免疫細(xì)胞，越來越被認(rèn)為是一種極具前途的免疫治療工具，目前已經(jīng)正在進(jìn)行各種臨床試驗(yàn)。為了獲得大量的高純度和高細(xì)胞毒性的nk細(xì)胞，包括外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmcs)、臍帶血(ucb)、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipscs)和nk細(xì)胞系在內(nèi)的各種材料，已被用作產(chǎn)生nk細(xì)胞用于免疫治療的來源。

2、目前常規(guī)nk來源主要采用非全密閉條件下，使用ficoll分離液分離外周血、臍帶血、骨髓等材料，材料中nk占比不高，例：外周血中t細(xì)胞(cd3+)占比約為50％～84％，nk細(xì)胞(cd3-、cd16+和/或cd56+)占比約為7％～40％(參見，朱立華、王建中，“中國(guó)人血液淋巴細(xì)胞免疫表型參考值調(diào)查”，《中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志》，1998.21(4)：223-226，且存在以下不足：

3、1.在生物安全柜內(nèi)操作，非全密閉制備，對(duì)環(huán)境要求高，且有污染及交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

4、2.ficoll分離液一般為科研試劑，應(yīng)用于臨床有較大風(fēng)險(xiǎn)。

5、3.對(duì)人員操作依賴較大，批次間不穩(wěn)定。

6、4.單個(gè)核細(xì)胞回收率較低。

7、5.獲得的單個(gè)核細(xì)胞中t細(xì)胞占比高，影響后續(xù)nk細(xì)胞培養(yǎng)純度。

8、因此，本領(lǐng)域存在對(duì)解決上述問題與不足的方法和系統(tǒng)的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在第一方面，本技術(shù)提供了一種富集血液樣品中自然殺傷(nk)細(xì)胞的方法，所述方法包括：

2、a)向所述血液樣品中添加靶向紅細(xì)胞表面抗原和t細(xì)胞表面抗原的雙特異性抗體和紅細(xì)胞沉降劑，待沉降過程后，分離上層部分，得到富集nk細(xì)胞的組分；

3、b)處理所述富集nk細(xì)胞的組分，所述處理步驟包括以下中的一項(xiàng)或多項(xiàng)：細(xì)胞洗滌、調(diào)節(jié)細(xì)胞密度、取樣用于對(duì)nk細(xì)胞計(jì)數(shù)和/或檢測(cè)nk細(xì)胞性質(zhì)、凍存液置換；

4、c)收集經(jīng)步驟b)處理后的nk細(xì)胞；以及

5、d)任選地，對(duì)nk細(xì)胞進(jìn)行凍存；

6、其中至少步驟a)至步驟c)在全封閉的方式進(jìn)行，優(yōu)選以全封閉自動(dòng)化的方式進(jìn)行。

7、在第二方面，本技術(shù)提供了一種富集血液樣品中自然殺傷(nk)細(xì)胞的全封閉系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：

8、沉降容器(例如，沉降袋)，所述沉降容器被配置為接收所述血液樣品并允許所述血液樣品在其中發(fā)生沉降過程；

9、沉降發(fā)生物提供裝置，所述沉降發(fā)生物包括靶向紅細(xì)胞表面抗原和t細(xì)胞表面抗原的雙特異性抗體和紅細(xì)胞沉降劑，所述沉降發(fā)生物提供裝置與所述沉降容器流體連接，并且被配置為將所述沉降發(fā)生物提供至所述沉降容器；

10、分離裝置(例如，分漿夾)，所述分離裝置被配置為對(duì)所述沉降容器中的多相液體進(jìn)行相分離；

11、細(xì)胞處理裝置，所述細(xì)胞處理裝置被配置為對(duì)所述富集nk細(xì)胞的部分進(jìn)行以下中的一項(xiàng)或多項(xiàng)處理：細(xì)胞洗滌、調(diào)節(jié)細(xì)胞密度、取樣用于對(duì)nk細(xì)胞計(jì)數(shù)和/或檢測(cè)nk細(xì)胞性質(zhì)、凍存液置換；以及

12、任選地，收集容器(例如，收集袋)，所述收集容器用于收集經(jīng)所述細(xì)胞處理裝置處理的所述富集nk細(xì)胞的部分，

13、其中所述系統(tǒng)優(yōu)選為全封閉自動(dòng)化系統(tǒng)。

14、在第二方面的一些實(shí)施方案中，所述沉降發(fā)生物提供裝置通過接管將所述沉降發(fā)生物提供至所述沉降容器。

15、在第一方面和/或第二方面的一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體靶向紅細(xì)胞上的cd235a分子和t細(xì)胞上的cd3分子，并且包含cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域和cd3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中：

16、所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含第一輕鏈可變區(qū)和第一重鏈可變區(qū)，所述第一輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為rassnvkymy(seq?id?no.22)的lcdr1，氨基酸序列為ytsnlas(seqid?no.23)的lcdr2，和氨基酸序列為qqftsspyt(seq?id?no.24)的lcdr3，所述第一重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為syfmh(seq?id?no.25)的hcdr1，氨基酸序列為mirpnggttdynekfkn(seq?id?no.26)的hcdr2，和氨基酸序列為wegsyyaldy(seq?id?no.27)的hcdr3，并且

17、所述cd3結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含第二輕鏈可變區(qū)和第二重鏈可變區(qū)，所述第二輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為rasssvsymn(seq?id?no.28)的lcdr1，氨基酸序列為dtskvas(seq?idno.29)的lcdr2，和氨基酸序列為qqwssnplt(seq?id?no.30)的lcdr3，所述第二重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列為rytmh(seq?id?no.31)的hcdr1，氨基酸序列為yinpsrgytnynqkfkd(seqid?no.32)的hcdr2，和氨基酸序列為yyddhycldy(seq?id?no.33)的hcdr3，

18、其中，hcdr和lcdr的氨基酸序列根據(jù)kabat定義；

19、優(yōu)選地，所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列如seq?id?no.6所示的第一輕鏈可變區(qū)和氨基酸序列如seq?id?no.7所示的第一重鏈可變區(qū)，和/或所述cd3結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列如seq?id?no.18所示的第二輕鏈可變區(qū)和氨基酸序列如seq?id?no.17所示的第二重鏈可變區(qū)。

20、在第一方面和/或第二方面的一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體還包含重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)；優(yōu)選地，所述重鏈恒定區(qū)為人igg4亞型，更優(yōu)選地，所述重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.10或seq?idno.21所示；和/或所述輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.11所示；

21、任選地，其中所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一輕鏈可變區(qū)與所述輕鏈恒定區(qū)相聯(lián)，以形成所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域的輕鏈，并且所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一重鏈可變區(qū)與所述重鏈恒定區(qū)相聯(lián)，以形成所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈；優(yōu)選地，所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域的輕鏈的氨基酸序列如seq?id?no.13所示和/或所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈的氨基酸序列如seq?id?no.14所示；

22、任選地，其中所述cd3結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閱捂溈贵w(scfv)形式，例如為通過第一接頭形成第二重鏈可變區(qū)-第一接頭-第二輕鏈可變區(qū)的結(jié)構(gòu)；例如，所述第一接頭為gs型柔性接頭，優(yōu)選地，所述第一接頭的氨基酸序列如seq?id?no.16所示；任選地，所述cd3結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seq?id?no.19所示；

23、任選地，其中所述cd3結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重鏈恒定區(qū)相聯(lián)，以形成融合重鏈并且所述融合重鏈與所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域的輕鏈組合，以形成所述雙特異性抗體，優(yōu)選地，所述cd3結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過第二接頭與所述cd235a結(jié)合結(jié)構(gòu)域相聯(lián)；例如，所述第二接頭為gs型柔性接頭，優(yōu)選地所述第二接頭的氨基酸序列如seq?id?no.15所示；任選地，所述融合重鏈的氨基酸序列如seq?id?no.20所示；

24、任選地，所述雙特異性抗體為包含來自小鼠的可變區(qū)和來自人類的恒定區(qū)的四價(jià)igg4分子。

25、在第一方面和/或第二方面的一些實(shí)施方案中，其中所述紅細(xì)胞沉降劑包括羥乙基淀粉、明膠、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮和/或甲基纖維素。

26、在第一方面的一些實(shí)施方案中，b)中的處理步驟包括凍存液置換。在第二方面的一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞處理裝置包括凍存液置換模塊，用于對(duì)所述富集nk細(xì)胞的組分進(jìn)行凍存液置換。在一些具體實(shí)施方案中，所述凍存液包含一種或多種冷凍保護(hù)劑。所述冷凍保護(hù)劑例如為滲透性冷凍保護(hù)劑(例如，二甲亞砜、甘油、乙二醇、丙二醇、乙酰胺和/或甲醇)和/或非滲透性冷凍保護(hù)劑(例如，聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白和/或羥乙基淀粉)。在一些具體實(shí)施方案中，所述凍存液還包含一種或多種氨基酸和/或維生素。例如，所述凍存液可以包含二甲亞砜(例如，終濃度≤5％)、右旋糖酐、海藻酸鈉、海藻糖、人血白蛋白、山梨糖醇、復(fù)方電解質(zhì)、氯化鈉注射液、葡萄糖氯化鈉注射液、右旋糖酐40葡萄糖注射液、復(fù)合氨基酸注射液、復(fù)合維生素b注射液。

27、在第一方面和/或第二方面的一些實(shí)施方案中，所述血液樣品是源自供者的外周血樣品和/或臍帶血樣品。所述供者可以經(jīng)歷篩選，例如通過病原微生物(例如，乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、梅毒螺旋體、人類免疫缺陷病毒(hiv)、epstein-barr病毒(ebv)、巨細(xì)胞病毒(cmv)、人類嗜t細(xì)胞病毒(htlv)、人細(xì)小病毒b19、人類皰疹病毒6/7/8型、腺病毒、jc病毒)檢測(cè)和/或遺傳病史進(jìn)行篩選。