本發(fā)明涉及蛋白印記膜,具體地說,涉及快速轉(zhuǎn)移蛋白的改進(jìn)型蛋白印記膜及其制備方法。
背景技術(shù):
1、蛋白印記是一種用于檢測、量化和驗(yàn)證蛋白質(zhì)存在的常用技術(shù),在進(jìn)行蛋白印記的過程中,通常需要將蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上,這個(gè)支持物就是所謂的“蛋白印記膜”;其中,蛋白印記膜是蛋白免疫印跡技術(shù)中使用的一種固相支持物,用于固定和檢測從凝膠中轉(zhuǎn)移出來的蛋白質(zhì)。蛋白印記膜的主要功能是提供一個(gè)穩(wěn)定的表面,使蛋白質(zhì)能夠附著在其上,并保持其空間結(jié)構(gòu)和生物活性,以便后續(xù)的檢測。
2、在高通量篩選實(shí)驗(yàn)中,需要在同一時(shí)間內(nèi)處理大量的樣本,在這種情況下,使用快速轉(zhuǎn)移蛋白的蛋白印記膜可以大大提高工作效率,減少實(shí)驗(yàn)周期;由于,膜表面存在過多的非特異性吸附位點(diǎn),這會(huì)降低檢測的特異性和靈敏度,為確保樣本的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性,鑒于此,我們提出快速轉(zhuǎn)移蛋白的改進(jìn)型蛋白印記膜及其制備方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供快速轉(zhuǎn)移蛋白的改進(jìn)型蛋白印記膜及其制備方法,以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供快速轉(zhuǎn)移蛋白的改進(jìn)型蛋白印記膜,包括以下組分:聚偏二氟乙烯10-20重量份、n,n-二甲基甲酰胺溶劑85-100重量份、纖維素納米晶增強(qiáng)劑3-5重量份、3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液1-2重量份、乙二胺溶液6-10重量份、過碘酸鈉溶液6-10重量份和edc/nhs交聯(lián)劑12-15重量份;
3、其中,edc/nhs交聯(lián)劑為濃度為5mg/ml?edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)和10mg/ml?nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)的混合物,且edc與nhs的摩爾比為1:1.2~1.5。
4、作為優(yōu)選,所述3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液濃度0.8%-1.2%?(v/v)。
5、作為優(yōu)選,所述乙二胺溶液濃度0.6-0.8%?(w/v)、過碘酸鈉溶液濃度0.5-0.7%(w/v)。
6、另一方面,本發(fā)明提供了快速轉(zhuǎn)移蛋白的改進(jìn)型蛋白印記膜的制備方法,用于上述中任意一項(xiàng)所述的快速轉(zhuǎn)移蛋白的改進(jìn)型蛋白印記膜,所述改進(jìn)型蛋白印記膜的制備方法如下:
7、制備聚偏二氟乙烯膜:
8、s1.1、分別稱取聚偏二氟乙烯10-20重量份、n,n-二甲基甲酰胺溶劑85-100重量份和纖維素納米晶增強(qiáng)劑3-5重量份;
9、并將纖維素納米晶增強(qiáng)劑分散在部分n,n-二甲基甲酰胺溶劑中,制備得到纖維素納米晶懸浮液;
10、s1.2、將聚偏二氟乙烯溶解于剩余的n,n-二甲基甲酰胺溶劑中,制備得到聚偏二氟乙烯溶液;
11、s1.3、將纖維素納米晶懸浮液加入到聚偏二氟乙烯溶液中,攪拌均勻直至完全分散;
12、s1.4、將混合好的溶液倒入模具中,通過澆鑄法形成膜;
13、s1.5、將膜放置在烘箱中加熱固化,直到溶劑完全揮發(fā),得到聚偏二氟乙烯膜;
14、纖維素納米晶(cnc)因其高長徑比、大比表面積和優(yōu)異的機(jī)械性能,可以增強(qiáng)膜的強(qiáng)度和穩(wěn)定性;pvdf是一種具有高化學(xué)穩(wěn)定性和良好蛋白吸附性能的聚合物;通過將cnc與pvdf混合,可以制備出具有更優(yōu)性能的聚偏二氟乙烯膜。
15、對(duì)聚偏二氟乙烯膜進(jìn)行表面改性:
16、s2.1、分別稱取3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液1-2重量份、乙二胺溶液6-10重量份、過碘酸鈉溶液6-10重量份和交聯(lián)劑12-15重量份;
17、同時(shí),通過氧等離子體處理來活化聚偏二氟乙烯膜表面;氧等離子體處理可以引入極性基團(tuán)(如羥基和羧基),用于增加膜的親水性和表面能,有利于后續(xù)的化學(xué)反應(yīng);
18、s2.2、將活化后的聚偏二氟乙烯膜浸泡至3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液中,持久浸泡并反應(yīng)18-24h,在聚偏二氟乙烯膜表面引入環(huán)氧基團(tuán),為后續(xù)的胺基化和羧基化反應(yīng)提供反應(yīng)位點(diǎn);
19、s2.3、將步驟s2.2經(jīng)過環(huán)氧基團(tuán)功能化的聚偏二氟乙烯膜浸入乙二胺溶液中,并在ph為9-11的條件下,浸泡12-16h,使乙二胺溶液中與環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng),生成伯胺基團(tuán)(-nh2),增加了膜的正電荷密度,有利于蛋白的吸附;
20、s2.4、將經(jīng)過步驟s2.3處理過的聚偏二氟乙烯膜浸入過碘酸鈉溶液,將環(huán)氧基團(tuán)氧化成羧基(-cooh),羧基具有較強(qiáng)的電荷密度,可以與蛋白的氨基形成穩(wěn)定的離子鍵,提高蛋白的結(jié)合能力;
21、s2.5、將edc/nhs交聯(lián)劑溶解在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶劑中,得到edc/nhs溶液,將含有羧基的聚偏二氟乙烯膜浸泡在edc/nhs溶液中,活性酯與膜表面的氨基反應(yīng),形成酰胺鍵;
22、使用edc/nhs活化羧基,使其能夠與膜表面的氨基或其他含有活潑氫的基團(tuán)反應(yīng),形成穩(wěn)定的酰胺鍵,進(jìn)一步增強(qiáng)膜與蛋白的結(jié)合力;
23、s2.6、反應(yīng)完成后,用水清洗聚偏二氟乙烯膜,去除未反應(yīng)的edc/nhs和其他副產(chǎn)品;
24、最后,將聚偏二氟乙烯膜放置在烘箱中干燥,去除殘留的溶劑和水分,得到改進(jìn)型蛋白印記膜;
25、在膜表面引入羧基,并進(jìn)一步通過edc/nhs活化來增強(qiáng)膜的功能性,使其能夠更好地結(jié)合蛋白質(zhì);
26、具體的,通過纖維素納米晶與pvdf的復(fù)合,以及膜表面的功能化改性,可以有效提高蛋白印記膜的性能,包括蛋白吸附能力、選擇性和穩(wěn)定性。
27、作為優(yōu)選,所述s1.1中,纖維素納米晶懸浮液濃度為2-3%?(w/v)。
28、作為優(yōu)選,所述s1.2中,聚偏二氟乙烯溶液濃度為15-20%?(w/v)。
29、作為優(yōu)選,所述s1.5中,在100-150°c溫度下,持續(xù)固化3-4h。
30、作為優(yōu)選,所述s2.1中,通過氧等離子體處理來活化聚偏二氟乙烯膜表面的具體步驟為:
31、將聚偏二氟乙烯膜放置在等離子體反應(yīng)器內(nèi),關(guān)閉反應(yīng)器,開始抽真空直至達(dá)到160-240?mtorr,開始通入高純度氧氣(氧氣純度為99.99%以上),氧氣流量10-50?sccm,開啟等離子體發(fā)生器,設(shè)置功率50-300瓦特,使氧氣電離產(chǎn)生等離子體,設(shè)定處理時(shí)間30-45min,處理完成后,停止等離子體發(fā)生器,等待聚偏二氟乙烯膜冷卻至室溫,并緩慢引入空氣恢復(fù)常壓,取出經(jīng)過處理的聚偏二氟乙烯膜;聚偏二氟乙烯膜表面應(yīng)該被成功活化,增加了其表面的極性和反應(yīng)活性,從而有利于后續(xù)的化學(xué)改性步驟。
32、作為優(yōu)選,所述s2.5中,edc/nhs溶液中,edc/nhs交聯(lián)劑與n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶劑的混合比例為2:1。
33、作為優(yōu)選,所述s2.6中,聚偏二氟乙烯膜在40-60℃條件下,干燥16-18h。
34、與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果:
35、1、該快速轉(zhuǎn)移蛋白的改進(jìn)型蛋白印記膜及其制備方法中,在制備聚偏二氟乙烯膜時(shí),通過添加纖維素納米晶增強(qiáng)劑,用于提高膜的強(qiáng)度和穩(wěn)定性;并采用3-縮水甘油氧丙基三甲氧基硅烷溶液對(duì)聚偏二氟乙烯膜進(jìn)行表面改性,在聚偏二氟乙烯膜上引入胺基(-nh2)和羧基(-cooh),這些基團(tuán)與蛋白質(zhì)分子上的相反電荷基團(tuán)形成靜電相互作用,從而增強(qiáng)蛋白的吸附能力。
36、2、該快速轉(zhuǎn)移蛋白的改進(jìn)型蛋白印記膜及其制備方法中,使用乙二胺,在堿性條件下與環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng),生成伯胺基團(tuán)(-nh2),通過碘酸鈉將環(huán)氧基團(tuán)氧化成羧基(-cooh),edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和nhs(n-羥基琥珀酰亞胺)一起使用,將羧基(-cooh)和伯胺基(-nh2)連接起來形成酰胺鍵,減少了膜表面的非特異性吸附位點(diǎn),提高了實(shí)驗(yàn)的特異性和靈敏度;
37、其中,edc用于激活羧基,使其成為良好的離去基團(tuán),nhs作為輔助試劑,與被edc活化的羧基反應(yīng),形成不穩(wěn)定的nhs酯中間體,nhs酯中間體與伯胺基反應(yīng),形成穩(wěn)定的酰胺鍵,可以減少非特異性吸附,提高實(shí)驗(yàn)的特異性和靈敏度。