本發(fā)明涉及生物工程，具體涉及絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、肺線蟲(chóng)病(lungworm?disease，hoose)是威脅全球人類健康和動(dòng)物質(zhì)量以及公共衛(wèi)生安全的重要疾病之一。絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)[dictyocaulus?filaria(rudolphi，1809)]是引起肺線蟲(chóng)病的重要病原體之一，該寄生蟲(chóng)生活在氣管和細(xì)支氣管中，宿主對(duì)感染的反應(yīng)導(dǎo)致支氣管炎和嗜酸性粒細(xì)胞肺炎及呼吸性細(xì)支氣管阻塞，可造成呼吸困難、咳嗽、發(fā)熱、食欲不振、生長(zhǎng)發(fā)育不良甚至死亡。

2、通過(guò)可靠的檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確診斷肺線蟲(chóng)病是制定針對(duì)性防治措施的前提，對(duì)有效控制肺線蟲(chóng)病具有重要意義。目前，肺線蟲(chóng)病的診斷大多依賴于鏡檢，常被作為診斷肺線蟲(chóng)病的“金標(biāo)準(zhǔn)”(yaghoub?firouzivand.a?field?outbreak?of?dictyocaulus?filaria?insheep?in?the?northwest?of?iran.j?altern?vet?med,2023,6(18):1097-2002.)。但顯微鏡檢查方法易漏檢寄生蟲(chóng)形態(tài)特征不明顯、感染早期寄生蟲(chóng)數(shù)量較少、有亞臨床癥狀的病例。肺線蟲(chóng)病的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法。血清學(xué)試驗(yàn)在肺線蟲(chóng)病治療成功后數(shù)周或數(shù)月仍可檢測(cè)到絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)特異性抗體，而且由于與其他病原感染引起的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)，還存在假陽(yáng)性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)(parfitt?jw,sinclair?ij.crossresistance?to?dictyocaulus?viviparus?produced?by?dictyocaulus?filariainfections?in?calves.res?vet?sci,1967,8(1):6-13.)。因此，需要可靠的檢測(cè)技術(shù)，及時(shí)準(zhǔn)確地診斷肺線蟲(chóng)病，防止其廣泛傳播。由于與血清學(xué)檢測(cè)相關(guān)的挑戰(zhàn)，分子檢測(cè)已成為檢測(cè)某些致病原感染的首選診斷檢測(cè)方法。對(duì)于寄生蟲(chóng)學(xué)診斷，分子檢測(cè)具有很高的特異性，因?yàn)槠淇梢詸z測(cè)寄生蟲(chóng)特異性的核酸，較好地解決了傳統(tǒng)顯微鏡檢查寄生蟲(chóng)方法容易漏診早期感染病例的“卡脖子”問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了解決上述問(wèn)題，提供絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法及試劑盒。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒，包含引物和taqman探針，所述引物和taqman探針的核苷酸序列如下所示：

3、正向引物：5'-aacctgagcctgcagaaacattat-3'；

4、反向引物：5'-ccacaggttttgcaaacgctata-3'；

5、taqman探針：5'-aaagttgcgaagcag-3'。

6、進(jìn)一步的，所述taqman探針的5'端標(biāo)記fam熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記mgb-nfq淬滅基團(tuán)。

7、根據(jù)上述探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明還提供了絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法，包括以下步驟：

8、s1、獲取待檢測(cè)絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)樣本，并提取待測(cè)樣本dna；

9、s2、配制探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)體系：取10μl?taqman?mix、8μl無(wú)核酸酶純水、1μl引物和taqman探針mix、1μl模板dna；

10、s3、進(jìn)行探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)：將配制好的20μl反應(yīng)體系加入到探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)管中進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)時(shí)采集熒光信號(hào)；

11、s4、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：取1μl經(jīng)10倍系列稀釋后的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行與樣本相同的探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)，實(shí)時(shí)采集熒光信號(hào)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

12、s5、數(shù)據(jù)分析：將檢測(cè)樣本測(cè)得的ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得待測(cè)樣品的濃度；根據(jù)測(cè)得的ct值對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。

13、優(yōu)選的，步驟s1中，所述絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)樣本取自全血、直腸拭子、血清、腦、心臟、肺臟、肝臟、膽囊、腎臟、腸、膀胱的其中一個(gè)或多個(gè)。

14、優(yōu)選的，步驟s2中，所述引物和taqman探針mix中的正向引物應(yīng)用濃度為440nm、反向引物應(yīng)用濃度為440nm、taqman探針應(yīng)用濃度為120nm。

15、優(yōu)選的，步驟s3中，所述探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr的擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃2min，1個(gè)循環(huán)；95℃10min，1個(gè)循環(huán)；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。

16、優(yōu)選的，步驟s3中，所述建立標(biāo)準(zhǔn)曲線具體包括以下步驟：

17、s301、配制含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行10倍系列稀釋，11個(gè)濃度，依次為1.5×1010拷貝/μl到1.5×100拷貝/μl；

18、s302、取1μl經(jīng)10倍系列稀釋后的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，進(jìn)行與樣本相同的實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)；

19、s303、實(shí)時(shí)采集各稀釋濃度對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

20、優(yōu)選的，所述定性結(jié)果判讀方式如下：在探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)質(zhì)量在控情況下，若被檢樣品ct值≤35并出現(xiàn)特異的s型熒光擴(kuò)增曲線，則判定為相應(yīng)被檢測(cè)物陽(yáng)性；若無(wú)ct值且無(wú)特異的熒光擴(kuò)增曲線，則判定為相應(yīng)被檢測(cè)物陰性；若35＜ct值＜40并出現(xiàn)特異的熒光擴(kuò)增曲線，則判定為不確定樣本，需重新提取核酸后進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢仍有s型熒光擴(kuò)增曲線且ct值＜40則判定相應(yīng)被檢測(cè)物為陽(yáng)性，否則判為陰性。

21、優(yōu)選的，所述定量結(jié)果判讀方式如下：將絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的目的片段構(gòu)建到pmd18-t載體上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到j(luò)m109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒dna，經(jīng)酶切電泳測(cè)序鑒定正確后作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定質(zhì)粒dna濃度，通過(guò)拷貝數(shù)換算公式轉(zhuǎn)換成具體的質(zhì)?？截悢?shù)，進(jìn)行10倍系列稀釋，以各稀釋濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)，以模板濃度的lg值為x軸，以對(duì)應(yīng)的ct值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)樣本的ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)拷貝數(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。

22、優(yōu)選的所述檢測(cè)方法對(duì)絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的檢出限為1.5拷貝/μl。

23、本發(fā)明方案涉及的序列：

24、正向引物：5'-aacctgagcctgcagaaacattat-3'；

25、反向引物：5'-ccacaggttttgcaaacgctata-3'；

26、taqman探針：5'-aaagttgcgaagcag-3'。

27、taqman探針的5'端標(biāo)記fam熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記mgb-nfq淬滅基團(tuán)。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本方案的有益效果：

29、1、首次建立了絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)方法，利用此檢測(cè)方法可以對(duì)臨床不同樣本如全血、直腸拭子、血清、腦、心臟、肺臟、肝臟、膽囊、腎臟、腸、膀胱中的絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)進(jìn)行定性和/或定量檢測(cè)。

30、2、本檢測(cè)方法與絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的其他傳統(tǒng)檢測(cè)方法如鏡檢、elisa法、常規(guī)pcr相比，靈敏度較高，具有取樣便捷，檢測(cè)效率得到了很大的提高，并且有效的防止了污染。

31、3、本檢測(cè)方法與絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的其他傳統(tǒng)檢測(cè)方法，如鏡檢、elisa法、常規(guī)pcr相比，具有操作程序簡(jiǎn)單易用的特點(diǎn)，并可進(jìn)一步制成檢測(cè)試劑盒，操作程序化，適合大面積推廣和應(yīng)用。

32、4、本檢測(cè)方法不僅能夠評(píng)價(jià)動(dòng)物的絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)感染狀況，同時(shí)也為絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的流行病學(xué)、致病機(jī)理等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供了技術(shù)儲(chǔ)備。

33、5、本檢測(cè)方法也可用于人用動(dòng)物源性生物制品中外源性絲狀網(wǎng)尾線蟲(chóng)的污染監(jiān)測(cè)，為生物制品的安全性檢驗(yàn)提供了有效工具。