本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于生物工程。

背景技術(shù)：

1、琥珀酸又稱丁二酸，是一種重要的c4平臺(tái)化合物。它在自然界中廣泛存在，是多種生物體代謝途徑中的中間產(chǎn)物。琥珀酸及其衍生物在化工、醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，琥珀酸被美國(guó)能源部列為12種最有潛力大宗生物基化學(xué)品中的首位。

2、傳統(tǒng)的琥珀酸生產(chǎn)主要依賴化學(xué)合成方法，包括石蠟氧化、氯乙酸甲酯氰化水解以及五氧化二釩催化加氫等技術(shù)。然而，隨著石油資源的日益稀缺和環(huán)境污染問(wèn)題的加劇，這些化學(xué)合成途徑的不足之處逐漸暴露。作為替代，通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸不僅能夠減少對(duì)不可再生資源石油的依賴，還能利用可再生資源，有助于二氧化碳的固定，從而減緩溫室效應(yīng)，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3、目前，研究者們已經(jīng)探索了多種微生物菌株用于琥珀酸的生產(chǎn)，主要包括產(chǎn)琥珀酸放線桿菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌和大腸桿菌。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能夠耐受較高濃度的琥珀酸鹽，其中g(shù)uettler?m等人通過(guò)使用突變株fz53，實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖為原料在48小時(shí)內(nèi)達(dá)到110g/l的高產(chǎn)率。盡管如此，關(guān)于該菌種的生理特性、發(fā)酵性能和遺傳背景的研究還相對(duì)有限，需要進(jìn)一步深入。產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌則能夠利用多種發(fā)酵底物，如葡萄糖、乳糖和甘油。samuelov等人的研究表明，在最佳條件下，該菌株能夠?qū)崿F(xiàn)1.2mol琥珀酸/1.0mol葡萄糖的產(chǎn)率，最高產(chǎn)量達(dá)到65.0g/l。但是，由于該菌株的發(fā)酵過(guò)程需要嚴(yán)格的厭氧條件，這在工業(yè)應(yīng)用中可能面臨挑戰(zhàn)。大腸桿菌作為研究透徹的模式菌株，遺傳背景清晰，易于遺傳操作，使其成為發(fā)酵琥珀酸生產(chǎn)的研究熱點(diǎn)。例如，李嬌嬌等人使用大腸桿菌yl104h，通過(guò)兩階段發(fā)酵65h，實(shí)現(xiàn)了61.66g/l的琥珀酸濃度和0.95g/l/h的生產(chǎn)強(qiáng)度。vemuri等人利用重組大腸桿菌afp111，通過(guò)76h的兩階段發(fā)酵，達(dá)到了99.2g/l的琥珀酸濃度，產(chǎn)率達(dá)到1.1g/g葡萄糖，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.3g/l/h。張學(xué)禮等人通過(guò)基因工程和適應(yīng)性進(jìn)化策略構(gòu)建的重組大腸桿菌hx024，采用一步厭氧法發(fā)酵96h，最終產(chǎn)量達(dá)到95.9g/l，產(chǎn)率為1g/g葡萄糖。朱麗雯等人通過(guò)優(yōu)化ppc和pck基因的表達(dá)，強(qiáng)化了co2固定路徑，使得重組大腸桿菌afp111菌株在96h發(fā)酵后，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到90.7g/l。張建國(guó)等人通過(guò)優(yōu)化葡萄糖吸收代謝路徑，并敲除副產(chǎn)物乙酸編碼基因，實(shí)現(xiàn)了65h發(fā)酵后98.92g/l的琥珀酸產(chǎn)量。唐文秀等人在敲除副產(chǎn)物基因的基礎(chǔ)上，通過(guò)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)特定酶基因，發(fā)酵96h，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到了137g/l。

4、研究表明，利用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)琥珀酸具備顯著的應(yīng)用潛力與優(yōu)勢(shì)，尤其是在增強(qiáng)產(chǎn)量、提升生產(chǎn)效率以及優(yōu)化生產(chǎn)工藝等方面。然而，目前采用大腸桿菌進(jìn)行琥珀酸發(fā)酵生產(chǎn)存在若干技術(shù)瓶頸：發(fā)酵周期較長(zhǎng)，長(zhǎng)期厭氧條件下導(dǎo)致細(xì)胞死亡率上升，糖酸轉(zhuǎn)化率降低；此外，為了維持發(fā)酵過(guò)程中的ph穩(wěn)定，需要大量添加中和劑，這不僅增加了生產(chǎn)成本，也提高了產(chǎn)品分離純化的成本。因此，開(kāi)發(fā)具有快速琥珀酸生產(chǎn)能力的菌株對(duì)于縮短發(fā)酵周期至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種在較低ph下高產(chǎn)率琥珀酸的重組大腸桿菌構(gòu)建方法及其應(yīng)用，在宿主菌fmme-n-5中導(dǎo)入了來(lái)自谷氨酸棒桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ptsg，并優(yōu)化了其啟動(dòng)子和rbs，來(lái)加快葡萄糖利用速率，同時(shí)采用crispr-cas9基因編輯技術(shù)過(guò)表達(dá)谷氨酸依賴性耐酸系統(tǒng)gadbc，同時(shí)優(yōu)化其啟動(dòng)子、rbs和拷貝數(shù)，提高ptsg、gadbc的表達(dá)強(qiáng)度。

2、本發(fā)明提供了在較低ph條件下高產(chǎn)率琥珀酸的重組大腸桿菌，在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)谷氨酸棒桿菌來(lái)源的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ptsg，加快葡萄糖利用速率，并過(guò)表達(dá)gadbc基因。

3、在一種實(shí)施方式中，所述重組大腸桿菌還將gadbc的啟動(dòng)子替換為pj23119，并將gadbc的rbs序列替換為rbs34。

4、在一種實(shí)施方式中，所述過(guò)表達(dá)是表達(dá)一個(gè)或多個(gè)拷貝數(shù)的gadbc。

5、在一種實(shí)施方式中，所述過(guò)表達(dá)是在ilvg、rph、ylbe、ygay、adhe中的多個(gè)位點(diǎn)整合gadbc。

6、在一種實(shí)施方式中，所述過(guò)表達(dá)是分別在ilvg和rph位點(diǎn)整合gadbc。

7、在一種實(shí)施方式中，所述替換葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是以整合耐酸基因后的重組大腸桿菌為宿主菌。

8、在一種實(shí)施方式中，基因ilvg的核苷酸序列如基因id：2847699所示；基因rph的核苷酸序列如基因id：948156所示；基因ylbe的核苷酸序列如基因id：938216所示；基因ygay的核苷酸序列如基因id：2847696所示；基因adhe的核苷酸序列如基因id：945837所示。

9、在一種實(shí)施方式中，基因ecptsg的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述谷氨酸棒狀桿菌來(lái)源的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因cgptsg的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

10、在一種實(shí)施方式中，用啟動(dòng)子pj23119和rbs34調(diào)控cgptsg基因的表達(dá)。

11、在一種實(shí)施方式中，所述啟動(dòng)子pj23119的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述rbs34的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

12、在一種實(shí)施方式中，所述gadbc基因的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

13、在一種實(shí)施方式中，所述大腸桿菌fmme-n-5公開(kāi)于公開(kāi)號(hào)為cn112239738a的專利申請(qǐng)文件中。

14、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述高產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

15、(1)制備大腸桿菌e.coli?fmme-n-5的感受態(tài)，將質(zhì)粒pcas-lac轉(zhuǎn)化到胞內(nèi)獲得含pcas-lac質(zhì)粒的受體菌；

16、(2)構(gòu)建ptargetf-n20質(zhì)粒，根據(jù)所要替換的ptsg、gadbc的啟動(dòng)子和rbs34，設(shè)計(jì)n20核苷酸序列，并進(jìn)行全質(zhì)粒pcr；

17、(3)構(gòu)建donordna，根據(jù)所要插入的pj23119和rbs34設(shè)計(jì)同源臂，最后進(jìn)行一步同源重組整合在一起；

18、(4)通過(guò)電轉(zhuǎn)將ptargetf-n20質(zhì)粒和donordna導(dǎo)入至宿主菌株中；

19、(5)iptg誘導(dǎo)質(zhì)粒pcas-lac質(zhì)粒上sgrna的轉(zhuǎn)錄消除ptargetf-n20質(zhì)粒；

20、(6)重復(fù)步驟(1)～(5)，整合gadbc；

21、(7)不加任何抗生素37℃過(guò)夜培養(yǎng)，消除pcas-lac質(zhì)粒。

22、在一種實(shí)施方式中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ptsg和谷氨酸脫羧酶依賴性耐酸系統(tǒng)gadbc是通過(guò)crispr-cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行操作，采用rbs序列和啟動(dòng)子優(yōu)化表達(dá)谷氨酸脫羧酶依賴性耐酸系統(tǒng)gadbc。

23、在一種實(shí)施方式中，在步驟(1)中制作含有pcas-lac質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)時(shí)，將質(zhì)粒pcas-lac轉(zhuǎn)化到胞內(nèi)獲得含pcas-lac質(zhì)粒的受體菌。

24、在一種實(shí)施方式中，在步驟(2)中構(gòu)建ptargetf-n20質(zhì)粒時(shí)，根據(jù)所要替換的基因ptsg，pj23119-rbs34-gadbc，在網(wǎng)站(https://www.benchling.com/)上找到合適的n20核苷酸序列，并進(jìn)行全質(zhì)粒pcr。

25、在一種實(shí)施方式中，在步驟(3)構(gòu)建donordna時(shí)，根據(jù)所要插入的基因ptsg，pj23119-rbs34-gadbc，設(shè)計(jì)同源臂，最后進(jìn)行一步同源重組整合在一起。

26、在一種實(shí)施方式中，在步驟(3)中，將根據(jù)所要替換的基因ptsg構(gòu)建的ptargetf-n20質(zhì)粒及donordna采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至含有pcas-lac質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)中；步驟(3)中包括將根據(jù)pj23119-rbs34-gadbc構(gòu)建的ptargetf-n20質(zhì)粒及donordna采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至含有pcas-lac質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)中的步驟。

27、在一種實(shí)施方式中，在步驟(5)中，采用iptg誘導(dǎo)。

28、在一種實(shí)施方式中，在步驟(5)-(6)中，通過(guò)壯觀霉素及卡那霉素抗性平板篩選獲得工程菌。

29、在一種實(shí)施方式中，步驟(3)-(6)的方法可實(shí)現(xiàn)循環(huán)的基因組編輯。

30、在一種實(shí)施方式中，在步驟(7)中不加任何抗生素37℃過(guò)夜培養(yǎng)步驟(6)構(gòu)建的菌株，以消除pcas-lac質(zhì)粒。

31、本發(fā)明還提供一種發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法，所述方法采用所述的重組大腸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行有氧-厭氧兩階段發(fā)酵，可選地，收集發(fā)酵液中的琥珀酸。

32、在一種實(shí)施方式中，用于發(fā)酵的培養(yǎng)基含有：葡萄糖40-45g/l，玉米漿10-15g/l，(nh4)2so4?2-4g/l，k2hpo4?1～3g/l，kh2po4?0.5～0.9g/l，mgso4·7h2o?0.5～0.9g/l。

33、在一種實(shí)施方式中，所述的有氧-厭氧兩階段發(fā)酵是先在有氧環(huán)境下發(fā)酵直至發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡，且od600達(dá)到40～55時(shí)，轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵。

34、在一種實(shí)施方式中，所述的有氧-厭氧兩階段發(fā)酵是在ph升高(發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡)后0.25～1小時(shí)，od600達(dá)到40～55，將有氧階段轉(zhuǎn)為厭氧階段。

35、在一種實(shí)施方式中，將有氧階段轉(zhuǎn)為厭氧階段是通過(guò)通入co2氣體或者添加按終濃度計(jì)3～7g/l碳酸氫鹽的方式進(jìn)行。

36、在一種實(shí)施方式中，在厭氧階段，控制葡萄糖濃度為0～5g/l。

37、在一種實(shí)施方式中，所述的有氧-厭氧兩階段發(fā)酵的接種量，按體積百分比計(jì)，為5-15％；發(fā)酵溫度為35-38℃。

38、在一種實(shí)施方式中，所述的有氧-厭氧兩階段發(fā)酵的發(fā)酵時(shí)間為26～48h。

39、在一種實(shí)施方式中，在厭氧階段，添加ph中和劑，所述ph中和劑為na2co3、k2co3、naoh、koh、caco3、mgco3一種或幾種混合。

40、本發(fā)明還提供了所述重組大腸桿菌或所述方法在生產(chǎn)琥珀酸或含琥珀酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

41、有益效果：

42、(1)本發(fā)明采用crispr-cas9基因編輯技術(shù)將大腸桿菌中編碼葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ptsg替換為谷氨酸棒狀桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ptsg，在不影響菌體生長(zhǎng)速度的同時(shí)加快葡萄糖的消耗速率，提高琥珀酸的積累積累效率。

43、(2)本發(fā)明還采用rbs序列和啟動(dòng)子策略優(yōu)化表達(dá)谷氨酸脫羧酶依賴性耐酸系統(tǒng)gadbc，有效提高了菌株耐酸與耐高滲的能力。

44、(3)本發(fā)明構(gòu)建的高產(chǎn)琥珀酸的重組大腸桿菌在5l發(fā)酵罐上采用兩階段發(fā)酵策略，發(fā)酵36h，琥珀酸產(chǎn)量達(dá)到了104.23g/l，厭氧階段琥珀酸得率達(dá)到1.09g/g葡萄糖、生產(chǎn)強(qiáng)度為2.89g/l/h，副產(chǎn)物乳酸、甲酸不積累，乙酸4-5g/l，菌株不含質(zhì)粒，不存在質(zhì)粒丟失的風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)酵時(shí)不加入抗生素，且菌株發(fā)酵時(shí)間縮短，中和劑用量減少，成本降低，具有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。