本發(fā)明涉及合成生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及重組大腸桿菌及其生產(chǎn)l-甲硫氨酸的方法。

背景技術(shù)：

1、l-甲硫氨酸(l-met)，又名l-蛋氨酸，系統(tǒng)命名為(s)-2-氨基-4-甲硫基丁酸，屬于天冬氨酸家族氨基酸，也是8種必需氨基酸中唯一的含硫氨基酸。l-甲硫氨酸參與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)甲基作用，在蛋白質(zhì)合成、免疫、抗氧化和脂質(zhì)代謝等方面發(fā)揮重要的作用，具有重要的生理功能。而且l-甲硫氨酸是家禽類飼料的第一限制性氨基酸，豬類飼料的第二限制性氨基酸，其作為飼料添加劑是最大的消費市場，在國內(nèi)的需求量也大幅度增加，另外，l-甲硫氨酸在食品添加劑、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的需求也呈增長趨勢。

2、l-甲硫氨酸的合成方法主要包括化學(xué)合成法、生物酶催化法與微生物發(fā)酵法。通過化學(xué)法合成l-甲硫氨酸時，所用原料及中間產(chǎn)物如甲硫醇、氰化物等對環(huán)境不友好，并且生成的產(chǎn)物多為d,l-甲硫氨酸，還需進一步的消旋處理才能得到目標(biāo)產(chǎn)物，操作比較繁瑣。生物酶催化法是先利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)l-高絲氨酸琥珀酸酯，再加入甲硫醇，通過酶法生產(chǎn)l-甲硫氨酸，具有成本較高、生產(chǎn)調(diào)控過程復(fù)雜等缺點，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

3、微生物發(fā)酵法是利用生物質(zhì)為原料高效合成l-甲硫氨酸，具有反應(yīng)條件溫和、對環(huán)境友好等優(yōu)點。如申請公布號為cn?118109378?a的發(fā)明專利，公開了一種高產(chǎn)l-甲硫氨酸的大腸桿菌工程菌及其全發(fā)酵法生產(chǎn)l-甲硫氨酸的方法，所述工程菌株以重組菌株m2/pam為出發(fā)菌株，在基因組上用強啟動子ptrc替換cyspuwam基因簇、cysh基因、trxb基因、trxc基因中一種或多種的原啟動子。最終得到的高產(chǎn)l-甲硫氨酸的大腸桿菌工程菌菌株，產(chǎn)量為3.21g/l。但是其在合成l-甲硫氨酸的過程中，依然存在著發(fā)酵培養(yǎng)基中硫源利用效率不高的問題，不利于l-甲硫氨酸產(chǎn)量的提升。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，第一方面，本發(fā)明重構(gòu)了質(zhì)粒以及導(dǎo)入了該質(zhì)粒的重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌能夠通過發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)l-甲硫氨酸。

2、本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明提供了一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒為pamz，其是在pam質(zhì)粒上過表達編碼o-琥珀酰高絲氨酸巰基化酶的metz基因得到，所述metz基因來源于銅綠假單胞菌pao1；所述質(zhì)粒pam是以ptrc99a質(zhì)粒為基礎(chǔ)增強metafbr、yjeh、serafbr的質(zhì)粒；所述metz基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

4、seq?id?no.1：

5、atgactcaagactgggatgcaggtcgtcttgactctgacctggaaggcgctgcgttcgacaccttggcggttcgtgcaggtcagcgtcgtactccagaaggtgaacacggtgaagcgctgttcaccaccagctcttacgtgttccgtaccgcagctgatgctgctgctcgtttcgcaggtgaagttccgggtaacgtttactctcgttacaccaatccgaccgttcgtacctttgaagaacgtatcgcagcgctggaaggtgctgaacaggcggttgctaccgcttctggtatgtctgcaattctggcgctggttatgtctctgtgctcttctggtgatcacgttctggttagccgttctgtgttcggttccaccatctctctgttcgacaagtacttcaaacgtttcggtatccaggttgactatccgccgctgtctgacctggcagcatgggaagctgcgtgcaaaccgaacaccaaactgttcttcgttgaatctccgagcaatccgctggctgaactggttgacatcgcagcactggcagaaatcgctcacgctaaaggtgcgctgctggcggttgataactgcttctgcactccagcactgcaacagccgctgaaactgggtgctgatgttgtgatccactccgcgaccaaatacatcgacggtcagggccgtggtatgggtggtgtagtggcaggccgtggtgaacagatgaaagaagtggttggctttctgcgtaccgctggtccgaccttgtctccgttcaacgcttggctgtttctgaaaggcctggaaactctgcgtatccgtatgcaggcacactccgcatctgcgctggcattggcggaatggctggaacgtcagccaggtatcgaacgtgtttactacgctggtttgccatctcacccgcagcacgaactggcgcgtcgtcagcagtccggtttcggtgcggttgtttctttcgacgttaaaggtggtcgtgacgcagcttggcgtttcatcgacgcgactcgtatggttagcatcaccaccaaccttggcgatactaagaccactatcgcacatccagcgaccacctctcacggtcgtctgtctccagaagatcgtgcacgtgcaggtatcggtgattctctgatccgtgttgcagtaggtctggaagatttggacgacctgaaagcagacatggcacgtggtctggcagctctgtaa

6、本發(fā)明還提供了一種質(zhì)粒，所述質(zhì)粒為pamzk，其是在所述的pamz質(zhì)粒上過表達編碼nad+激酶的ppnk基因獲得；所述ppnk基因來源于谷氨酸棒狀桿菌scgg2，所述ppnk基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

7、seq?id?no.2：

8、atgactgcgccaactaacgcaggtgaactgcgtcgtgttctgctggttccacacactgg?tcgtagctctaacatcgaatctgcgatcttggcggctaaactgctggatgacgcgggtatcgatgttcgtgttctgatcaacgatgcggatgatccaatcgctgaacatccggtattgggccgtttcactcacgttcgtcacgcggcagacgctgcggaaggtgctgaactggttctcgttctgggtggtgatggtacgtttctgcgtgcggcagacatggcgcacgctgttgacctgccggtgctgggtatcaacctgggtcacgttggctttctggctgaatgggaatctgactctctggaagaagctctgaaacgtgttatcgaccgtgactaccgtatcgaagatcgtatgaccttgaccgttgttgttctggacggtggtggtgaagaaatcggtcgtggttgggcgctgaacgaagtgtctatcgagaacctgaaccgtcgtggtgttctggatgctactctggaagttgatgctcgtccggttgcaagtttcggttgcgacggcgttctgatctctactccgactggttctactgcttacgcattcagcgcaggtggtccggttctgtggccagaactggatgcgattctggtagttccgaacaacgcacacgctctgttcaccaaaccgctggtggttagtccgaaatctactgttgctgttgaatctaactctgatacctctgctgctatggctgttatggacggtttccgtccgattccaatgccgccgggtagccgtgttgaagttactcgtggtgaacgtccggttcgttgggttcgtctggactcttccccattcaccgatcgtctggtttccaaactgcgtctgccagttaccggctggcgtggtccgcagaaacaggcggagaacaaagatccgcgtagcgcgggttaa

9、本發(fā)明還提供了一種重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌通過將上述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到底盤菌株中得到。

10、作為優(yōu)選，所述底盤菌株為m2/pam；所述m2/pam的基因型為e.coliw3110δmetjδmetiδlysa?trc-meth?trc-metf?trc-cyse?trc-serb?trc-serc/pam。

11、作為優(yōu)選，所述重組大腸桿菌為m2/pamz，其是以m2/pam為底盤菌株，在pam質(zhì)粒上過表達上述的metz基因得到。

12、作為優(yōu)選，所述重組大腸桿菌是m2/pamzk，其是以上述的重組大腸桿菌m2/pamz為底盤菌株，在pamz質(zhì)粒上過表達上述的ppnk基因得到。

13、作為優(yōu)選，所述底盤菌株為m2-hpbc/pam；所述m2-hpbc/pam的基因型為e.coliw3110δmetjδmetiδlysa?trc-meth?trc-metf?trc-cyse?trc-serb?trc-serc?trc-cysptrc-cysh?trc-trxb?trc-trxc/pam。

14、底盤菌株m2-hpbc已在申請公布號為cn?118109378?a的發(fā)明專利中公開。

15、作為優(yōu)選，所述重組大腸桿菌為m2-hpbc/pamz，其是以m2-hpbc/pam為底盤菌株，在pam質(zhì)粒上過表達上述的metz基因得到。

16、作為優(yōu)選，所述重組大腸桿菌為m2-hpbc/pamzk，其是以上述的m2-hpbc/pamz為底盤菌株，在pamz質(zhì)粒上過表達上述的ppnk基因得到。

17、上述重組大腸桿菌m2/pamz、m2/pamzk按如下步驟構(gòu)建：

18、s1、以菌株m2/pam為底盤菌株，在質(zhì)粒上過表達經(jīng)過密碼子優(yōu)化的來源于銅綠假單胞菌pao1的o-琥珀酰高絲氨酸巰基化酶metz基因：以pam質(zhì)粒為模板，pam-x-f/pam-x-r引物獲得線性化質(zhì)粒pam；將線性化質(zhì)粒pam與seq?id?no.1所示密碼子優(yōu)化metz基因片段通過同源重組技術(shù)連接構(gòu)建質(zhì)粒pamz，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到菌株m2/pam感受態(tài)細(xì)胞中得到工程菌m2/pamz，即為能夠高產(chǎn)l-甲硫氨酸的重組大腸桿菌m2/pamz；

19、s2、以菌株m2/pamz為底盤菌株，在質(zhì)粒上過表達經(jīng)過密碼子優(yōu)化的來源于谷氨酸棒狀桿菌scgg2的nad+激酶ppnk基因：以pamz質(zhì)粒為模板，pamz-x-f/pamz-x-r引物獲得線性化質(zhì)粒pamzk；將線性化質(zhì)粒pamz與seq?id?no.2所示密碼子優(yōu)化ppnk基因片段通過同源重組技術(shù)連接構(gòu)建質(zhì)粒pamzk，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到菌株m2/pamz感受態(tài)細(xì)胞中得到工程菌m2/pamzk，即為能夠高產(chǎn)l-甲硫氨酸的重組大腸桿菌m2/pamzk。

20、第二方面，本發(fā)明還提供了上述的重組大腸桿菌生產(chǎn)l-甲硫氨酸的方法，將所述重組大腸桿菌接種至含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于35～39℃、180～220rpm的搖床上過夜培養(yǎng)12～14h，再將培養(yǎng)液以體積濃度3～8％接種量接種到硫源培養(yǎng)基中，發(fā)酵結(jié)束后，獲得含l-甲硫氨酸的發(fā)酵液；所述lb培養(yǎng)基包括：蛋白胨9～11g/l、酵母粉4～6g/l、氯化鈉9～11g/l，溶劑為去離子水。

21、作為優(yōu)選，所述硫源培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和硫源，基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/l)包括以下質(zhì)量份的組分：

22、葡萄糖25.0～35.0、kh2po40.5～1.5、mgcl20.1～0.3、酵母粉1.5～2.5、feso4·7h2o?0.003～0.007、mnso4·8h2o?0.003～0.007、znso40.003～0.007，溶劑為去離子水，ph自然；

23、所述硫源(g/l)選自以下質(zhì)量份組分的組合中的至少一種：

24、(nh4)2so415.0～17.0和na2so41.0～3.0的組合、

25、(nh4)2so415.0～17.0和na2s2o31.0～3.0的組合、

26、(nh4)2so415.0～17.0和na2s2o30.5～1.5和na2so40.5～1.5的組合、

27、(nh4)2so415.0～17.0和na2s2o30.5～1.5和(nh4)2s2o30.5～1.5的組合。

28、作為優(yōu)選，所述硫源培養(yǎng)基(g/l)包括以下質(zhì)量份的組分：

29、葡萄糖25.0～35.0、kh2po40.5～1.5、mgcl20.1～0.3、酵母粉1.5～2.5、feso4·7h2o?0.003～0.007、mnso4·8h2o?0.003～0.007、znso40.003～0.007、(nh4)2so412.0～20.0、na2s2o31.0～10，溶劑為去離子水，ph自然。

30、作為優(yōu)選，所述硫源培養(yǎng)基中硫酸根與硫代硫酸根的質(zhì)量比為(2～10):(1～2)。

31、作為優(yōu)選，所述硫源培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：27～33℃、180r～220pm條件下發(fā)酵培養(yǎng)40～56h。

32、l-甲硫氨酸，系統(tǒng)命名為(s)-2-氨基-4-甲硫基丁酸，在硫源培養(yǎng)基中，硫酸銨作為氮源和硫源，且硫代硫酸鈉與硫酸銨組合是適合生產(chǎn)l-甲硫氨酸的硫源組合，硫源物質(zhì)的利用率高。但培養(yǎng)基中含有硫代硫酸鈉時，會產(chǎn)生硫化氫，對重組大腸桿菌的生長造成傷害。

33、通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，其他微生物可以利用硫化氫合成l-甲硫氨酸，稱作直接巰基化途徑：即o-琥珀酰高絲氨酸巰基化酶以o-琥珀酰高絲氨酸作為底物，硫化氫作為硫供體，一步合成同型半胱氨酸，再通過甲基化生成l-甲硫氨酸。

34、本發(fā)明在pam質(zhì)粒上過表達編碼o-琥珀酰高絲氨酸巰基化酶的metz基因得到pamz；并以m2/pam為底盤菌株，得到重組大腸桿菌m2/pamz，以m2-hpbc/pam為底盤菌株，得到重組大腸桿菌m2-hpbc/pamz。

35、大腸桿菌合成l-甲硫氨酸需要消耗大量的輔因子，合成1mol?l-甲硫氨酸需要消耗8mol?nadph(還原型輔酶ⅱ)，為提高胞內(nèi)nadph水平，因此引入谷氨酸棒狀桿菌scgg2編碼nad+激酶的ppnk基因。

36、所以本發(fā)明在pamz質(zhì)粒上過表達編碼nad+激酶的ppnk基因獲得pamzk；并以m2/pamz為底盤菌株，得到重組大腸桿菌m2/pamzk，以m2-hpbc/pamz為底盤菌株，得到重組大腸桿菌m2-hpbc/pamzk。

37、使用上述四種大腸桿菌在硫源培養(yǎng)基中通過發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)l-甲硫氨酸時，能夠減少硫化氫對細(xì)胞的毒害作用，有利于大腸桿菌生長和l-甲硫氨酸的合成。

38、本發(fā)明具有以下有益效果：

39、本發(fā)明通過重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)l-甲硫氨酸，通過對發(fā)酵培養(yǎng)時使用的硫源培養(yǎng)基進行硫源優(yōu)化，提升硫源利用效率，進而提升l-甲硫氨酸產(chǎn)量；

40、在優(yōu)化過程中利用醋酸鉛試紙檢測到培養(yǎng)基中有硫化氫的產(chǎn)生，因此在質(zhì)粒pam中引入表達編碼o-琥珀酰高絲氨酸巰基化酶的metz基因，得到質(zhì)粒pamz，并將其導(dǎo)入到菌株m2/pam、m2-hpbc/pam中，得到重組大腸桿菌m2/pamz和m2-hpbc/pamz，減少硫化氫對細(xì)胞的毒害作用，有利于提升l-甲硫氨酸產(chǎn)量，其中m2/pamz菌株的l-甲硫氨酸的產(chǎn)量在搖瓶水平上達到2.80g/l，m2-hpbc/pamz菌株的l-甲硫氨酸的產(chǎn)量在搖瓶水平上達到3.42g/l；

41、進一步在質(zhì)粒pamz中引入表達編碼nad+激酶的ppnk基因，并將其導(dǎo)入到菌株m2/pamz、m2-hpbc/pamz中，得到重組大腸桿菌m2/pamzk和m2-hpbc/pamzk，提高胞內(nèi)nadph水平，進一步提升l-甲硫氨酸產(chǎn)量，其中，m2/pamzk菌株的l-甲硫氨酸的產(chǎn)量在搖瓶水平上達到3.05g/l，m2-hpbc/pamzk菌株的l-甲硫氨酸的產(chǎn)量在搖瓶水平上達到3.47g/l。