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      重組大腸桿菌及其生產(chǎn)L-甲硫氨酸的方法

      文檔序號(hào):40357899發(fā)布日期:2024-12-18 13:35閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

      技術(shù)特征:

      1.一種質(zhì)粒,其特征在于,所述質(zhì)粒為pamz,其是在pam質(zhì)粒上過(guò)表達(dá)編碼o-琥珀酰高絲氨酸巰基化酶的metz基因得到,所述metz基因來(lái)源于銅綠假單胞菌pao1;所述質(zhì)粒pam是以ptrc99a質(zhì)粒為基礎(chǔ)增強(qiáng)metafbr、yjeh、serafbr的質(zhì)粒;所述metz基因的核苷酸序列如seqid?no.1所示。

      2.一種質(zhì)粒,其特征在于,所述質(zhì)粒為pamzk,其是在權(quán)利要求1所述的pamz質(zhì)粒上過(guò)表達(dá)編碼nad+激酶的ppnk基因獲得;所述ppnk基因來(lái)源于谷氨酸棒狀桿菌scgg2,所述ppnk基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

      3.一種重組大腸桿菌,其特征在于,所述重組大腸桿菌通過(guò)將權(quán)利要求1~2任一項(xiàng)所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到底盤菌株中得到。

      4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌,其特征在于,所述底盤菌株為m2/pam;所述m2/pam的基因型為e.coli?w3110δmetjδmetiδlysa?trc-meth?trc-metf?trc-cyse?trc-serb?trc-serc/pam。

      5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌,其特征在于,所述底盤菌株為m2-hpbc/pam;所述m2-hpbc/pam的基因型為e.coli?w3110δmetjδmetiδlysa?trc-meth?trc-metf?trc-cyse?trc-serb?trc-serc?trc-cysh?trc-cysp?trc-trxb?trc-trxc/pam。

      6.一種重組大腸桿菌生產(chǎn)l-甲硫氨酸的方法,其特征在于,將權(quán)利要求3~5任一項(xiàng)所述重組大腸桿菌接種至含有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中,于35~39℃、180~220rpm的搖床上過(guò)夜培養(yǎng)12~14h,再將培養(yǎng)液以體積濃度3~8%接種量接種到硫源培養(yǎng)基中,發(fā)酵結(jié)束后,獲得含l-甲硫氨酸的發(fā)酵液;所述lb培養(yǎng)基包括:蛋白胨9~11g/l、酵母粉4~6g/l、氯化鈉9~11g/l,溶劑為去離子水。

      7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述硫源培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和硫源,基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/l)包括以下質(zhì)量份的組分:

      8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述硫源培養(yǎng)基(g/l)包括以下質(zhì)量份的組分:

      9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,所述硫源培養(yǎng)基中硫酸根與硫代硫酸根的質(zhì)量比為(2~10):(1~2)。

      10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述硫源培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:27~33℃、180~220rpm條件下發(fā)酵培養(yǎng)40~56h。


      技術(shù)總結(jié)
      本發(fā)明公開(kāi)了重組大腸桿菌及其生產(chǎn)L?甲硫氨酸的方法。本發(fā)明通過(guò)重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)L?甲硫氨酸,通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)使用的硫源培養(yǎng)基進(jìn)行硫源優(yōu)化,提升硫源利用效率,提升L?甲硫氨酸產(chǎn)量;在優(yōu)化過(guò)程中利用醋酸鉛試紙檢測(cè)到培養(yǎng)基中有硫化氫的產(chǎn)生,因此在質(zhì)粒pAm中引入表達(dá)編碼O?琥珀酰高絲氨酸巰基化酶的metZ基因,得到質(zhì)粒pAmZ,并將其導(dǎo)入到菌株M2/pAm、M2?HPBC/pAm中,得到重組大腸桿菌M2/pAmZ和M2?HPBC/pAmZ,減少硫化氫對(duì)細(xì)胞的毒害作用,有利于提升L?甲硫氨酸產(chǎn)量;進(jìn)一步在質(zhì)粒pAmZ中引入表達(dá)編碼NAD<supgt;+</supgt;激酶的ppnk基因,并將其導(dǎo)入到菌株M2/pAmZ、M2?HPBC/pAmZ中,得到重組大腸桿菌M2/pAmZK和M2?HPBC/pAmZK,提高胞內(nèi)NADPH水平,進(jìn)一步提升L?甲硫氨酸產(chǎn)量。

      技術(shù)研發(fā)人員:牛坤,蔡文斌,張巧玲,陳懋欽,柳志強(qiáng),鄭裕國(guó)
      受保護(hù)的技術(shù)使用者:浙江工業(yè)大學(xué)
      技術(shù)研發(fā)日:
      技術(shù)公布日:2024/12/17
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