本發(fā)明涉及羰基還原酶突變體及其催化合成高濃度玻色因的方法，屬于生物催化領域。

背景技術：

1、玻色因，商品名為pro-xylanetm，化學名為羥丙基四氫吡喃三醇(cas：439685-79-7)，由歐萊雅公司首先發(fā)現(xiàn)具有延緩衰老功能的一種木糖衍生物。玻色因可防止糖胺聚糖和蛋白聚糖的體內(nèi)活性減少和降解，促進其在表皮細胞中的合成，以增加皮膚結合水的能力和提高皮膚的生物防御能力。玻色因易于生物降解，不會在生物體內(nèi)積累，沒有毒性，這種特性進一步增加了玻色因在生物、醫(yī)藥、化妝品等領域的應用熱度。

2、早期玻色因的合成方法主要集中在化學法，比如專利《nouveaux?dérivés?c-glycosides?et?utilization(新型碳糖酐及其應用)》(專利號wo02/051828al)首次批露了玻色因的原研制備方法。該方法以d-木糖為原料，加水溶解后加入乙酰丙酮和碳酸氫鈉，木糖和乙酰丙酮在堿性水溶液中發(fā)生knoevenagel縮合獲得β-丙酮木糖苷，再通過硼氫化鈉作用還原酮基，得到四羥基化合物β-丙酮木糖苷醇，即玻色因。其中，β-丙酮木糖苷的選擇性還原是難點。專利《一種c-糖苷衍生物的制備方法》(申請公布號cn?102040575?a)中提出使用raney鎳型催化劑；專利《化妝品有效成分玻色因的改進合成方法》(申請公布號cn113773291?a)使用貴金屬ru/c催化劑還原中間體β-丙酮木糖苷，避免硼氫化鈉帶來的雜質和毒性物質。但這些常規(guī)化學還原反應存在以下問題：立體選擇性不高；三廢排放較高，環(huán)境污染嚴重；反應需要高壓氫氣所需設備復雜，存在安全隱患等。特別是一些使用過渡金屬催化的反應，增加純化難度，且在產(chǎn)品中會存在金屬殘留，這對于醫(yī)藥和化妝品活性物尤為不利。

3、生物酶法合成玻色因更加安全高效，成本低廉，立體選擇性專一且對環(huán)境更加友好。玻色因的生物酶法合成關鍵在于7位的酮羰基還原為羥基。目前已報道的生物合成玻色因用酶主要為醇脫氫酶adhs(ec?1.1.1.1)。深圳瑞德林生物技術有限公司在專利《一種酶組合物及化學酶法合成玻色因的方法》(申請公布號cn?113717997?a)中，使用羰基還原酶還原34g/l中間體β-丙酮木糖苷，合成玻色因，產(chǎn)率93％?！兑环N一鍋法合成高濃度(s)-構型玻色因的方法》(申請公布號cn?115896199?a)報道的短鏈羰基還原酶lkcr催化190g/l底物，但需要的總反應時間偏長，為36h。專利《一種脫氫酶突變體及其在合成s-玻色因中的應用》(申請公布號cn?116926028?a)使用的脫氫酶kpadh突變體可在4-6h左右以99％以上轉化率催化100g/l的底物生成玻色因。但由于生物催化劑利用還原型輔酶(nadh或nadph)催化β-丙酮木糖苷酮基加氫生成羥丙基四氫吡喃三醇和氧化型輔酶(nad+或nadp+)，葡萄糖脫氫酶pmgdh介導的輔酶循環(huán)會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，即可溶性葡萄糖酸，極大地增加目標產(chǎn)物分離純化的難度。

4、因此，篩選更高效更低成本的玻色因合成酶體系，降低副產(chǎn)物分離困難，對于玻色因的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明以來自canariomyces?notabilis的羰基還原酶為模板酶，通過理性設計獲得一株優(yōu)異的重組玻色因合成酶菌株。詳細表征了該玻色因合成酶的酶學性質，和最優(yōu)催化反應的條件。同時，利用蛋白質工程技術，改造該重組玻色因合成酶，全細胞催化合成玻色因，并對轉化反應條件近行優(yōu)化，顯著提升了產(chǎn)物pro-xylanetm的合成效率。在50l規(guī)模下，高效合成玻色因，該方法產(chǎn)品分離提純簡單高效，為工業(yè)化高效制備奠定了基礎。

2、本發(fā)明提供了羰基還原酶突變體，所述突變體為，將羰基還原酶的第37位、第87位、第98位、第200位、第208位、第295位中的至少一個進行突變后得到的；所述羰基還原酶為氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶，或與氨基酸序列如seq?id?no.1所示的序列具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性的羰基還原酶。

3、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述羰基還原酶突變體包含位點37、87、98、200、208、295位置的一個或者多個氨基酸取代。

4、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述羰基還原酶突變體的催化效率是以第一中間β-丙酮木糖苷為底物進行全細胞反應，經(jīng)hplc檢測其產(chǎn)物峰面積衡量的。

5、本發(fā)明提供了一種羰基還原酶突變體，所述羰基還原酶突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位，第87位，第98位，第200位，第208位，第295位中的一個或多個氨基酸進行突變后得到的。

6、seq?id?no.1所示氨基酸序列為本實驗室挖掘的來自c.notabilis的羰基還原酶。

7、seq?id?no.1序列為：

8、mtateapgahskgkvlltggtgfvashvldclldhgfevvvtarseekgqriiqsidtplkknvsyvvvgnvadegafdeavksnppfdyvvhtaspyqftwndpvkecldpaikgttgilksikafapsvkrvvitsssaailsppnhptkvynesfwcdltweqalnpvhtyraskgsphqkfaekaawsfvetekpnfdlatinntytfgpiprsldslssesinasnkriydlvagnmregieptqpvftfvdvrdvalahvramtvpgaggkrfyvvggffsnprlaaiirdrfpqledrlppadtpddfpddhfecdvsrsrevlgleytsleksvadtvesilrfegr

9、在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述羰基還原酶親本核苷酸序列如seq?idno.2所示。

10、seq?id?no.2

11、atgactgcgacggaggcccctggtgcccactctaaaggtaaagttctgctgactggtggcactggttttgttgcgtcccatgtactggactgtctgctggatcacggcttcgaagttgttgttaccgcccgttccgaagaaaaaggtcagcgtatcatccagtccatcgataccccgctgaaaaaaaacgtgtcctacgttgtcgtaggtaacgtggccgacgaaggtgcgtttgacgaagctgtgaagtctaacccaccgtttgattacgtggttcacaccgcgtccccgtaccagttcacgtggaacgatccggttaaagagtgtctggacccagccattaagggtactacgggtattctgaaatccatcaaagccttcgcgccgtctgtcaaacgcgttgttattacttcctcctctgccgccatcctgtctcctccaaaccatcctaccaaagtgtacaacgagtctttttggtgcgacctgacgtgggagcaagccctgaacccggttcatacctatcgcgcgtccaagggttctccacaccaaaaattcgccgagaaggcagcctggtcctttgtagaaaccgagaaaccgaacttcgatctggctacgattaacaacacctacacttttggtccgattcctcgttccctggactccctgtcttccgaatctatcaacgcttctaacaaacgcatctacgatctggtggctggtaatatgcgcgaaggtatcgaaccgactcagccggtgttcaccttcgtagacgttcgtgacgttgcgctggcgcacgttcgtgctatgactgttccgggtgcgggtggtaaacgtttctatgtagttggtggtttcttcagcaatccgcgtctggcggctatcattcgtgatcgtttcccacaactggaggatcgtctgccgccggcagataccccggacgattttccggacgatcacttcgaatgtgacgtttcccgtagccgtgaagttctgggcctggaatatacctctctggaaaaatccgtagccgacaccgtggaatctatcctgcgcttcgaaggccgt

12、本發(fā)明提供了一種羰基還原酶突變體，所述羰基還原酶突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶進行突變后得到的突變體：f37a，f37c，f37d，p87s，p87a，p87f，y98k，n200s，n200t，n208q，i295c，i295q，f37c/p87a，f37c/i295c，y98k/n208q，p87a/i295c或f37c/p87a/i295c。

13、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼岬玫降?，命名為f37a；

14、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬玫降?，命名為f37c；

15、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)樘扉T冬氨酸得到的，命名為f37d；

16、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第87位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸得到的，命名為p87s；

17、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第87位的脯氨酸突變?yōu)楸彼岬玫降?，命名為p87a；

18、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第87位的脯氨酸突變?yōu)楸奖彼岬玫降模麨閜87f；

19、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第98位的酪氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，命名為y98k；

20、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第200位的天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸得到的，命名為n200s；

21、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第200位的天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸得到的，命名為n200t；

22、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第208位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝彼岬玫降模麨閚208q；

23、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第295位的異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬玫降?，命名為i295c；

24、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第295位的異亮氨酸突變?yōu)楣劝滨０返玫降模麨閕295q；

25、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔瑫r將第87位的脯氨酸突變?yōu)楸彼岬玫降?，命名為f37c/p87a；

26、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，同時將第295位的異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬玫降模麨閒37c/i295c；

27、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第87位的脯氨酸突變?yōu)楸彼?，同時將第295位的異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬玫降模麨閜87a/i295c；

28、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第98位的酪氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，同時將第208位的天門冬酰胺突變?yōu)楣劝彼岬玫降模麨閥98k/n208q；

29、或所述突變體為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔瑢⒌?7位的脯氨酸突變?yōu)楸彼?，同時將第295位的異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼岬玫降模麨閒37c/p87a/i295c；

30、本發(fā)明還提供了編碼上述突變體的基因。

31、本發(fā)明還提供了一種攜帶所述突變體，或攜帶上述基因的重組載體。

32、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組載體是以petduet系列載體如petduet-1、petduet?s2，pacyduet-1，pet系列載體如pet-28a質粒、pet-21a質粒，prsf系列載體如prsf-duet1質粒，pgex系列載體如pgex-6p-1質粒為表達載體。

33、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組載體以petduet-1質粒、pet28a質粒、prsf-duet1質粒、pet21a質?；騪gex-6p-1質粒為表達載體。

34、本發(fā)明還提供了一種表達上述突變體，攜帶上述基因，或攜帶上述重組載體的重組細胞。

35、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組細胞以細菌或真菌為表達宿主。

36、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組細胞以大腸桿菌為表達宿主。

37、本發(fā)明提供了攜帶所述羰基還原酶的重組載體。

38、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組載體以petduet-1、pet21a、prsf-duet1、pacy-duet1、pet21a或pgex-6p-1為表達載體。

39、本發(fā)明還提供了工程化羰基還原酶的酶學性質。包括最適溫度，ph，溫度穩(wěn)定性，ph穩(wěn)定性。

40、本發(fā)明還提供了一種含有上述羰基還原酶突變體序列的重組酶催化劑，是以下形式中的任意一種：

41、(1)培養(yǎng)所述的重組表達轉化體，分離含有所述重組酶的轉化體細胞；

42、(2)培養(yǎng)所述的重組表達轉化體，分離含有所述重組酶的轉化體細胞，對含有所述重組酶的轉化體細胞進行破碎，獲得的細胞破碎液；

43、(3)培養(yǎng)所述的重組表達轉化體，分離含有所述重組酶的轉化體細胞，對含有所述重組酶的轉化體細胞進行破碎，獲得的細胞破碎液，將所述重組酶的細胞破碎液經(jīng)冷凍干燥而得到的凍干酶粉。

44、本發(fā)明提供了一種重組大腸桿菌，所述重組大腸桿菌同時過表達了上述玻色因合成酶、來源于azospirillum?palustre的甲酸脫氫酶變體和來源于corynebacteriumglutamicum的nad+激酶。

45、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述重組大腸桿菌是采用pet-21a為表達載體，同時過表達了上述玻色因合成酶、來源于a.palustre的甲酸脫氫酶和來源于c.glutamicum的nad+激酶。

46、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述甲酸脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，編碼所述甲酸脫氫酶的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

47、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述nad+激酶的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，編碼所述nad+激酶的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

48、本發(fā)明還提供了一種提高羰基還原酶催化合成產(chǎn)物的非對映體選擇性和/或轉化率和/或產(chǎn)率的方法，所述方法為，將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)楸彼峄虬腚装彼?；或將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第87位的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸、丙氨酸苯丙氨酸；或將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶將第98位的酪氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔换驅被嵝蛄腥鐂eq?id?no.1所示的羰基還原酶將第200位的天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸或蘇氨酸；或將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶將第208位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝彼幔换驅被嵝蛄腥鐂eq?id?no.1所示的羰基還原酶的第295位的異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼峄蚬劝滨０?；或將氨基酸序列如seqid?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，同時第87位的脯氨酸突變?yōu)楸彼?；或將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔瑫r將第295位的異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼?；或將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶的第87位的脯氨酸突變?yōu)楸彼?，同時將第295位的異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔换驅被嵝蛄腥鐂eq?id?no.1所示的羰基還原酶的第98位的酪氨酸突變?yōu)橘嚢彼?，同時將第208位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝彼幔换驅被嵝蛄腥鐂eq?id?no.1所示的羰基還原酶的第37位的苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，將?7位的脯氨酸突變?yōu)楸彼幔瑫r將第295位的異亮氨酸突變?yōu)榘腚装彼帷?/p>

49、本發(fā)明還提供了一種制備玻色因的方法，所述方法為，以β-丙酮木糖苷為底物，再采用氨基酸序列如seq?id?no.1所示的羰基還原酶或上述突變體或上述重組細胞或上述重組大腸桿菌全細胞，以甲酸銨緩沖液為反應介質構成反應體系，轉化制備得到玻色因。

50、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述β-丙酮木糖苷可以購自上海adamas。

51、本發(fā)明的方法通過如下技術方案實現(xiàn)：

52、將緩沖液、購自上海adamas的β-丙酮木糖苷、催化劑、輔酶、輔助催化劑和輔底物在緩沖液中混合，于25-35℃下，轉化6-10h，轉化結束后，加入乙腈終止反應，萃取，合并有機相，加入無水硫酸鈉干燥，而后減壓旋蒸、除去溶劑，即得所述玻色因。

53、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述玻色因的獲得，是以β-丙酮木糖苷為底物，經(jīng)重組工程化羰基還原酶全細胞生物催化獲得。

54、所述反應通式如下所示：

55、

56、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述催化劑是將脫氫酶cnmdr野生型或其突變體編碼基因導入細胞或導入大腸桿菌構建獲得的基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體，或破碎液體，或酶制劑。

57、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述反應體系中，還含有甲酸脫氫酶或表達甲酸脫氫酶的重組細胞；所述甲酸脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no.3所示。

58、在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼甲酸脫氫酶的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

59、在本發(fā)明的一種實施方式中，反應體系中，還含有甲酸銨、nad+。

60、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述甲酸銨的濃度為150mm-1260mm。

61、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述β-丙酮木糖苷的濃度為100mm-1052mm。

62、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述nad+濃度為0.1mm-0.5mm。

63、在本發(fā)明的一種實施方式中，反應條件為ph為6.0-8.0；溫度為20℃-40℃。

64、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述羰基還原酶的全細胞催化體系包含但不限于β-丙酮木糖苷1052mm，nad+0.3mm，全細胞40mg/ml。反應緩沖液為1260mm的甲酸銨溶液(ph7.5)，反應時間為8小時，反應溫度為25-35℃，比如30℃。

65、在本發(fā)明的一種實施方式中，反應體系中，還含有甲酸銨、nadp+；優(yōu)選的，所述甲酸銨的濃度為150mm-1260mm；優(yōu)選的，所述β-丙酮木糖苷的濃度為100mm-1052mm；優(yōu)選的，所述nadp+濃度為0.1mm-0.3mm；優(yōu)選的，反應條件為ph為6.0-8.0；溫度為20℃-40℃；優(yōu)選的，所述羰基還原酶的全細胞催化體系包含但不限于β-丙酮木糖苷1052mm，nadp+0.3mm，全細胞40mg/ml；優(yōu)選的，反應緩沖液為1260mm的甲酸銨溶液(ph?7.5)，反應時間為8小時，反應溫度為25-35℃，比如30℃。

66、在本發(fā)明的一種實施方式中，反應體系中，還含有甲酸鈉、nad+；優(yōu)選的，所述甲酸鈉的濃度為150mm-1260mm；優(yōu)選的，所述β-丙酮木糖苷的濃度為100mm-1052mm；優(yōu)選的，所述nad+濃度為0.1mm-0.3mm；優(yōu)選的，反應條件為ph為6.0-8.0；溫度為20℃-40℃；優(yōu)選的，所述羰基還原酶的全細胞催化體系包含但不限于β-丙酮木糖苷1052mm，nad+0.3mm，全細胞40mg/ml；優(yōu)選的，反應緩沖液為1260mm的甲酸鈉溶液(ph?7.5)，反應時間為8小時，反應溫度為25-35℃，比如30℃。

67、在本發(fā)明的一種實施方式中，反應體系中，還含有甲酸鈉、nadp+；優(yōu)選的，所述甲酸鈉的濃度為150mm-1260mm；優(yōu)選的，所述β-丙酮木糖苷的濃度為100mm-1052mm；優(yōu)選的，所述nadp+濃度為0.1mm-0.3mm；優(yōu)選的，反應條件為ph為6.0-8.0；溫度為20℃-40℃；優(yōu)選的，所述羰基還原酶的全細胞催化體系包含但不限于β-丙酮木糖苷1052mm，nadp+0.3mm，全細胞40mg/ml。反應緩沖液為1260mm的甲酸鈉溶液(ph?7.5)，反應時間為8小時，反應溫度為25-35℃，比如30℃。

68、在本發(fā)明的一種實施方式中，反應體系中，還含有甲酸銨、nadp+；優(yōu)選的，所述甲酸銨的濃度為50mm；優(yōu)選的，所述β-丙酮木糖苷的濃度為100mm-1052mm；優(yōu)選的，所述nadp+濃度為0.1mm-0.3mm；優(yōu)選的，反應條件為ph為6.0-8.0；溫度為20℃-40℃；優(yōu)選的，所述的步驟(2)的緩沖液選自磷酸鉀緩沖液、pbs緩沖液、甲酸銨緩沖液、甲酸鈉緩沖液、和tris-鹽酸緩沖液，ph為7.0-8.0。優(yōu)選的為甲酸鹽緩沖液，反應的溫度為30℃，反應時間為8h。

69、在本發(fā)明的一種實施方式中，nad+激酶可以將胞內(nèi)nad+轉換為nadp+，從而減少nadp+的添加。

70、在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟(2)中轉化結束后，取樣200μl反應液于12,000×g離心3min，取100μl上清加進400μl?dd?h2o中，用0.22μm濾膜過濾，hplc檢測反應進程，當轉化率達90-99％時，調節(jié)反應體系ph至2.0-3.0，硅藻土過濾，并在濾液中加入乙酸乙酯進行多次萃取，旋轉蒸發(fā)脫去溶劑后得到羥丙基四氫吡喃三醇。

71、本發(fā)明還提供了一種耦合輔酶再生系統(tǒng)的兩步反應體系，所述輔酶循環(huán)系統(tǒng)是通過偶聯(lián)甲酸脫氫酶來實現(xiàn)的。其中甲酸脫氫酶主要是負責輔因子nadph/nadp+的循環(huán)再生。其反應的結構通式如下：

72、

73、在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟(2)中輔助催化劑和輔底物作用輔酶循環(huán)，輔助催化劑甲酸脫氫酶apfdh(輔底物為甲酸鹽)。

74、本發(fā)明還提供了一種放大的50l規(guī)模的反應體系，該反應體系包含但不限于β-丙酮木糖苷200g/l，0.3mm?nadp+，100mg/ml甲酸銨，全細胞40mg/ml。反應混合液在100l的反應釜中進行反應，轉速為300rpm，時間為8小時，反應溫度為25-35℃，比如30℃。

75、本發(fā)明還提供了上述羰基還原酶突變體或上述基因或重組載體，或上述重組細胞，或上述重組酶催化劑，或上述重組大腸桿菌，或上述方法在制備玻色因或含有上述玻色因的產(chǎn)品中的應用。

76、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述產(chǎn)品為化學品。

77、在本發(fā)明的一種實施方式中，所述產(chǎn)品包括不限于護膚品、彩妝產(chǎn)品、香皂產(chǎn)品、沐浴產(chǎn)品、洗發(fā)產(chǎn)品、護發(fā)產(chǎn)品。

78、有益效果

79、(1)由于本發(fā)明以β-丙酮木糖苷和甲酸銨作為底物、以篩選的脫氫酶作為催化劑、以nadp+為輔酶兩步制備出高價值的化妝品原料玻色因。該生物催化體系可適用1052mm底物β-丙酮木糖苷(200g/l)，8h底物的催化效率>99％，且輔酶循環(huán)過程中甲酸鹽被甲酸氫酶apfdh氧化生成的二氧化碳可直接從產(chǎn)物中分離。該方法具有催化效率高、適用底物濃度高和產(chǎn)物易于分離純化等優(yōu)點，適合工業(yè)化放大生產(chǎn)。

80、(2)本發(fā)明基于挖掘的羰基還原酶序列為模板，對其進行相關突變位點的突變，獲得了催化效率顯著提升的羰基還原酶突變體。

81、(3)本發(fā)明引入輔酶循環(huán)體系，構建兩步反應系統(tǒng)，經(jīng)過多酶催化反應條件的優(yōu)化，在50l規(guī)模的反應體系中，多酶反應一步提升了玻色因催化合成的產(chǎn)量。

82、(4)采用本發(fā)明的方法，構建兩步反應系統(tǒng)得到的玻色因的產(chǎn)量達到1050mm(合計200g/l)，非對映體選擇性(ee值)大于99％。該產(chǎn)量為目前酶催化報道的最高產(chǎn)量。全細胞生物催化反應一步完成，不需要繁瑣的步驟，無多余的副產(chǎn)物生成，反應條件溫和，對環(huán)境友好，是一種綠色高效的生物合成玻色因的方法。