本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種環(huán)境水體中高致病性細(xì)菌多重pcr定量檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、水是人類維持生命不可缺少的自然資源，水體中存在種類繁多的微生物，截至目前，已發(fā)現(xiàn)的水體致病微生物高達(dá)一千四百多種，包括細(xì)菌、病毒、原蟲等。介水傳染病是當(dāng)今世界所面臨的主要健康威脅之一，可造成災(zāi)難性后果，因此對(duì)水體中致病微生物的污染問題應(yīng)引起我們的高度重視?？焖?、高效、準(zhǔn)確確定水體中存在致病微生物種類及數(shù)量尤為重要。

2、傳統(tǒng)的飲用水中細(xì)菌檢測(cè)方法均需經(jīng)過(guò)多個(gè)復(fù)雜步驟，包括不同培養(yǎng)基培養(yǎng)增菌、分離培養(yǎng)及多種理化性質(zhì)的驗(yàn)證。這些過(guò)程不僅繁瑣、耗時(shí)，而且在細(xì)菌濃度較低或處于不可培養(yǎng)狀態(tài)(vbnc)的情況下，培養(yǎng)變得非常困難。這導(dǎo)致整體檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果偏差大，影響檢測(cè)的速度、靈敏度和特異性，同時(shí)也難以滿足當(dāng)前對(duì)批量樣品檢測(cè)的需求。隨著分子生物技術(shù)的飛速發(fā)展，近年來(lái)涌現(xiàn)出多種新方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、多重pcr、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(lamp)、熒光定量pcr和基因芯片等。然而，這些方法也各自存在一定的局限性。普通pcr可以實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的快速檢測(cè)，但其靈敏度較低，且無(wú)法進(jìn)行定量分析。相比之下，多重pcr允許在同一體系中檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)菌，但由于不同引物之間容易相互干擾，對(duì)引物的設(shè)計(jì)和質(zhì)量要求較高，增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性。lamp技術(shù)雖然具備反應(yīng)體系小、靈敏度高、特異性好的優(yōu)勢(shì)，但在擴(kuò)增過(guò)程中可能產(chǎn)生非特異性條帶，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。雖然多重pcr、lamp和基因芯片等方法具備同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的能力，但它們無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌的定量檢測(cè)。而熒光定量pcr雖然能夠進(jìn)行定量分析，但由于引物探針設(shè)計(jì)的限制，一次實(shí)驗(yàn)通常只能檢測(cè)一種致病菌。這些問題促使研究者們尋求更有效的解決方案。

3、鑒于此，探索和開發(fā)同時(shí)實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)致病菌的更為快速、高效且精準(zhǔn)的定量檢測(cè)方法，對(duì)于更好地滿足飲用水安全監(jiān)測(cè)的實(shí)際需求至關(guān)重要，在水體致病微生物檢測(cè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何快速、靈敏、特異、高效地檢測(cè)水體中的十二種致病菌。所要解決的技術(shù)問題不限于所描述的技術(shù)主題，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術(shù)主題。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了同時(shí)檢測(cè)多種微生物的組合物，所述組合物包括12對(duì)引物對(duì)，所述12對(duì)引物對(duì)的核苷酸序列可如seq?id?no.1-seq?id?no.24所示。

3、所述多種微生物可為如下12種微生物：鮑氏不動(dòng)桿菌(acinetobacterbaumannii)、嗜水氣單胞菌(aeromonas?hydrophila)、空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridium?perfringens)、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenic?escherichia?coli(etec))、阪崎腸桿菌(enterobacter?sakazakii)、糞腸球菌(enterococcus?faecalis)、產(chǎn)酸克雷伯菌(klebsiella?oxytoca)、堪薩斯分枝桿菌(mycobacterium?kansasii)、邦戈沙門氏菌(salmonella?bongori)、痢疾志賀氏菌(shigella?dysenteriae)和創(chuàng)傷弧菌(vibrio?vulnificus)。

4、進(jìn)一步地，所述組合物還可包括12個(gè)探針，所述12個(gè)探針的核苷酸序列可如seqidno.25-seq?id?no.36所示。

5、所述12對(duì)引物對(duì)和所述12個(gè)探針用于檢測(cè)所述12種微生物。

6、用于檢測(cè)鮑氏不動(dòng)桿菌的引物對(duì)由seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)鮑氏不動(dòng)桿菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.25所示；

7、用于檢測(cè)嗜水氣單胞菌的引物對(duì)由seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)嗜水氣單胞菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.26所示；

8、用于檢測(cè)空腸彎曲桿菌的引物對(duì)由seq?id?no.5和seq?id?no.6所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)空腸彎曲桿菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.27所示；

9、用于檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的引物對(duì)由seq?id?no.7和seq?id?no.8所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.28所示；

10、用于檢測(cè)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的引物對(duì)由seq?id?no.9和seq?id?no.10所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.29所示；

11、用于檢測(cè)阪崎腸桿菌的引物對(duì)由seq?id?no.11和seq?id?no.12所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)阪崎腸桿菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.30所示；

12、用于檢測(cè)糞腸球菌的引物對(duì)由seq?id?no.13和seq?id?no.14所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)糞腸球菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.31所示；

13、用于檢測(cè)產(chǎn)酸克雷伯菌的引物對(duì)由seq?id?no.15和seq?id?no.16所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)產(chǎn)酸克雷伯菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.32所示；

14、用于檢測(cè)堪薩斯分枝桿菌的引物對(duì)由seq?id?no.17和seq?id?no.18所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)堪薩斯分枝桿菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.33所示；

15、用于檢測(cè)邦戈沙門氏菌的引物對(duì)由seq?id?no.19和seq?id?no.20所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)邦戈沙門氏菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.34所示；

16、用于檢測(cè)痢疾志賀氏菌的引物對(duì)由seq?id?no.21和seq?id?no.22所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)痢疾志賀氏菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.35所示；

17、用于檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的引物對(duì)由seq?id?no.23和seq?id?no.24所示的兩條單鏈dna分子組成；用于檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的探針的核苷酸序列如seq?id?no.36所示。

18、上述組合物中，所述探針的5’端可標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端可標(biāo)記淬滅基團(tuán)。

19、進(jìn)一步地，所述熒光基團(tuán)可選自fam、vic、hex、tet、cy3、cy5、rox、joe、fitc、tet、ned、tamra、lc?red640、lc?red705、quasar705和texas?red。

20、進(jìn)一步地，所述淬滅基團(tuán)可選自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb和dabcy1。

21、所述組合物中各個(gè)探針的熒光基團(tuán)可以不同，例如基于試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不同探針可以標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，以便于區(qū)分和定量分析多個(gè)目標(biāo)序列；也可以標(biāo)記相同的熒光基團(tuán)，例如基于dna芯片進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，通過(guò)空間位置編碼來(lái)區(qū)分不同目標(biāo)序列，此時(shí)的探針可采用相同熒光基團(tuán)，依靠芯片上的物理布局準(zhǔn)確識(shí)別各個(gè)目標(biāo)。

22、本發(fā)明還提供了同時(shí)檢測(cè)多種微生物的試劑盒，所述試劑盒包括本文中任一所述的組合物。

23、進(jìn)一步地，所述試劑盒還可包括熒光定量pcr檢測(cè)所需的試劑。

24、進(jìn)一步地，所述試劑盒還可包括核酸提取試劑、dna聚合酶、dntps、mg2+溶液(如mgso4或mgcl2溶液)、pcr緩沖液(如tris-hcl)、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品中的一種或多種。

25、所述核酸提取試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，用于提取來(lái)自待測(cè)樣品中的核酸。例如，所述核酸提取試劑可包括裂解液(如異硫氰酸胍、鹽酸胍和檸檬酸三鈉中的任意一種或多種)、溶菌酶、蛋白酶k、洗滌液(如乙醇和/或胍鹽)和/或洗脫液(如te緩沖液)等。

26、所述陽(yáng)性對(duì)照品可與標(biāo)準(zhǔn)品相同，可為下述(1)或(2)：

27、(1)12種基因或其片段：鮑氏不動(dòng)桿菌abar基因或其片段、嗜水氣單胞菌aera基因或其片段、空腸彎曲桿菌hipo基因或其片段、產(chǎn)氣莢膜梭菌plc基因或其片段、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌esta基因或其片段、阪崎腸桿菌ompa基因或其片段、糞腸球菌gele基因或其片段、產(chǎn)酸克雷伯菌pehx基因或其片段、堪薩斯分枝桿菌hsp65基因或其片段、邦戈沙門氏菌stn基因或其片段、痢疾志賀氏菌ipah基因或其片段和創(chuàng)傷弧菌rtxa基因或其片段。

28、例如，12種基因片段可為：以鮑氏不動(dòng)桿菌為模板由seq?id?no.1和seq?id?no.2擴(kuò)增得到的基因片段、以嗜水氣單胞菌為模板由seq?id?no.3和seq?id?no.4擴(kuò)增得到的基因片段、以空腸彎曲桿菌為模板由seq?id?no.5和seq?id?no.6擴(kuò)增得到的基因片段、以產(chǎn)氣莢膜梭菌為模板由seq?id?no.7和seq?id?no.8擴(kuò)增得到的基因片段、以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌為模板由seq?id?no.9和seq?id?no.10擴(kuò)增得到的基因片段、以阪崎腸桿菌為模板由seq?idno.11和seq?id?no.12擴(kuò)增得到的基因片段、以糞腸球菌為模板由seq?id?no.13和seq?idno.14擴(kuò)增得到的基因片段、以產(chǎn)酸克雷伯菌為模板由seq?id?no.15和seq?idno.16擴(kuò)增得到的基因片段、以堪薩斯分枝桿菌為模板由seq?id?no.17和seq?id?no.18擴(kuò)增得到的基因片段、以邦戈沙門氏菌為模板由seq?id?no.19和seq?id?no.20擴(kuò)增得到的基因片段、以痢疾志賀氏菌為模板由seq?id?no.21和seq?id?no.22擴(kuò)增得到的基因片段、以創(chuàng)傷弧菌為模板由seq?id?no.23和seq?id?no.24擴(kuò)增得到的基因片段。

29、(2)陽(yáng)性質(zhì)粒：含有(1)中所述12種基因或其片段的重組載體。

30、所述陰性對(duì)照品可選自超純水(ddh2o)、蒸餾水、去離子水、注射用水和重蒸水。

31、進(jìn)一步地，所述試劑盒的檢測(cè)樣本可為環(huán)境樣本(如水、土壤、空氣等)。

32、所述試劑盒的各種試劑組分可以存在于分開的容器中，或者可以全部或部分預(yù)組合成試劑混合物。

33、所述試劑盒的組分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液狀態(tài)存在的情況下，這些成分的濃度或含量是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)不同需求而方便地確定的。例如，用于儲(chǔ)存的目的時(shí)，組分的濃度可以較高的形式存在，當(dāng)處于工作狀態(tài)或使用時(shí)，可通過(guò)稀釋上述較高濃度的溶液來(lái)將濃度降低至工作濃度。

34、進(jìn)一步地，所述試劑盒還可包括記載有本文中所述同時(shí)檢測(cè)多種微生物的方法的可讀性載體。所述可讀性載體可為關(guān)于實(shí)踐本發(fā)明方法的試劑盒說(shuō)明書(例如印刷形式的說(shuō)明書)或在其上已記錄了信息的計(jì)算機(jī)可讀的介質(zhì)(例如軟盤、cd等)。

35、本文所述試劑盒可為基于實(shí)時(shí)熒光定量pcr的檢測(cè)試劑盒。

36、本發(fā)明還提供了同時(shí)檢測(cè)多種微生物的dna芯片，所述dna芯片可包括本文中任一所述的組合物。

37、本文所述dna芯片所用載體可包括玻璃芯片、硅芯片、膜芯片(如硝酸纖維素膜和尼龍膜)和陶瓷芯片等。

38、本文所述dna芯片可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過(guò)原位合成寡核苷酸探針芯片(包括原位光引導(dǎo)合成技術(shù)、原位噴印合成技術(shù)和分子印章多次壓印合成法)或預(yù)先合成探針點(diǎn)樣芯片的方法進(jìn)行制備。具體地，可用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀將本發(fā)明的引物和探針(seq?idno.1-seq?id?no.36)點(diǎn)制在芯片載體上，點(diǎn)樣完成后將dna芯片置于干燥器中避光常溫靜置，使引物探針和芯片共價(jià)結(jié)合，制成dna芯片。

39、本發(fā)明還提供了本文中任一所述的組合物、所述試劑盒或所述dna芯片在檢測(cè)環(huán)境樣本中12種微生物中的應(yīng)用，所述12種微生物為鮑氏不動(dòng)桿菌、嗜水氣單胞菌、空腸彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌、阪崎腸桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、堪薩斯分枝桿菌、邦戈沙門氏菌、痢疾志賀氏菌和/或創(chuàng)傷弧菌。

40、本發(fā)明還提供了本文中任一所述的組合物在制備用于檢測(cè)所述12種微生物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

41、本文所述產(chǎn)品選自試劑、試劑盒、芯片、試紙和檢測(cè)卡。

42、本發(fā)明還提供了一種同時(shí)檢測(cè)多種微生物的方法，所述方法可包括如下步驟：

43、a1)提取待測(cè)樣品dna；

44、a2)以所述dna為模板，利用本文中任一所述的組合物、所述試劑盒或所述dna芯片進(jìn)行多重實(shí)時(shí)熒光定量pcr，根據(jù)pcr結(jié)果判斷所述待測(cè)樣品中含有微生物的情況。

45、上述方法中，所述多重實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)程序可為：25℃溶解2min；50℃溶解15min；95℃預(yù)變性10min；40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性3s，60℃退火延伸1min。

46、上述方法中，所述多重實(shí)時(shí)熒光定量pcr的反應(yīng)體系中，每個(gè)引物的濃度可為900nm，探針的濃度可為250nm。

47、進(jìn)一步地，所述根據(jù)pcr結(jié)果判斷所述待測(cè)樣品中含有微生物的情況可包括下述任一種方法：

48、(1)若待測(cè)樣品中某基因的ct值小于等于35，則判斷該樣品含擁有該基因的致病菌。若待測(cè)樣品中某基因的ct值大于35，則判斷該樣品不含有擁有該基因的致病菌；

49、(2)如果某基因的擴(kuò)增曲線為s型曲線，則判斷該樣品含擁有該基因的致病菌。如果某基因的擴(kuò)增曲線不為s型曲線，則判斷該樣品不含擁有該基因的致病菌。

50、進(jìn)一步地，可對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量分析，例如將已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度的樣品，與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增，根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)為ct值)。對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定量時(shí)，根據(jù)待測(cè)樣本的ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算出待測(cè)樣本的起始拷貝數(shù)。

51、本文所述待測(cè)樣品可為環(huán)境樣本，例如水、土壤、空氣等。

52、本發(fā)明所述方法可以是非疾病診斷目的、非疾病預(yù)后目的和非疾病治療目的。

53、所述多重pcr是采用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾個(gè)不同的dna片段的方法。多重pcr的設(shè)計(jì)遠(yuǎn)比單個(gè)pcr復(fù)雜，并不是簡(jiǎn)單地將多對(duì)特異性引物組合，其反應(yīng)體系的組成和反應(yīng)條件需要反復(fù)調(diào)整摸索，以適應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)片段的需要。

54、本發(fā)明通過(guò)精確設(shè)計(jì)針對(duì)特異性致病基因的引物和探針，并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了一種多重實(shí)時(shí)熒光定量pcr方法。該方法通過(guò)同時(shí)擴(kuò)增致病菌的特異性基因片段，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析獲得定量檢測(cè)結(jié)果，能夠定量、并且同時(shí)檢測(cè)水體(如飲用水)中常見的12種主要致病菌(鮑氏不動(dòng)桿菌、嗜水氣單胞菌、空腸彎曲桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌、阪崎腸桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、堪薩斯分枝桿菌、邦戈沙門氏菌、痢疾志賀氏菌和創(chuàng)傷弧菌)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

55、1)本發(fā)明方法中涉及的12種致病菌可同時(shí)在相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序中實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性基因片段擴(kuò)增，所做標(biāo)準(zhǔn)曲線完全滿足定量檢測(cè)的要求；降低了檢測(cè)成本，大大提高了檢測(cè)效率。

56、2)本發(fā)明方法中所用12種致病菌的特異性引物、探針均經(jīng)特異性、靈敏度檢測(cè)，其檢測(cè)水平等同于商品試劑盒；

57、3)本發(fā)明方法中所用12種致病菌的特異性引物、探針在之前研究中未見報(bào)道。

58、綜上，本發(fā)明的組合物可以開發(fā)成檢測(cè)試劑盒或dna芯片，可高覆蓋率、高通量、低成本地快速檢測(cè)多個(gè)樣本，具有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)。本發(fā)明的檢測(cè)方法不僅提高了檢測(cè)效率，還解決了定量檢測(cè)的難題，具有廣泛的應(yīng)用潛力，能夠更好地滿足飲用水監(jiān)測(cè)的需要。

59、術(shù)語(yǔ)定義

60、在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。

61、術(shù)語(yǔ)“熒光基團(tuán)”通常是指熒光化合物中的生色團(tuán)，即能產(chǎn)生熒光的基團(tuán)。

62、術(shù)語(yǔ)“淬滅基團(tuán)”通常是指用于消除熒光信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)。當(dāng)熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)接近時(shí)，淬滅基團(tuán)會(huì)吸收熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光，導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱或消失。

63、術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增曲線”通常是指通過(guò)熒光定量pcr得到的擴(kuò)增曲線圖。隨著pcr反應(yīng)的進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物不斷積累，熒光信號(hào)強(qiáng)度不斷增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光信號(hào)，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。通常，擴(kuò)增曲線的縱坐標(biāo)為熒光值，橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)。

64、術(shù)語(yǔ)“ct值”通常是指pcr擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，熒光值所對(duì)應(yīng)的pcr循環(huán)次數(shù)，也可理解為擴(kuò)增曲線與閾值線交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)。通常，相同的模板進(jìn)行相同循環(huán)的擴(kuò)增時(shí)，ct值相對(duì)固定。

65、術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)性對(duì)照(也稱擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照)”通常是指肯定能檢測(cè)到的一組對(duì)照，例如可以是靶基因(如基因組dna或cdna)、靶基因片段(如特異性保守片段)，也可以是含有靶基因或靶基因片段的質(zhì)粒、假病毒等，還可以是陽(yáng)性樣本對(duì)照(例如已知感染的樣本或已知必定可以得到預(yù)期結(jié)果的樣本)。陽(yáng)性對(duì)照的作用是可以防止pcr檢測(cè)中因靶dna丟失或降解、dna聚合酶失活、pcr儀器故障等問題而出現(xiàn)的假陰性。

66、術(shù)語(yǔ)“陰性對(duì)照(也稱擴(kuò)增陰性對(duì)照)”通常是指肯定不會(huì)檢測(cè)到的一組對(duì)照，例如可以是無(wú)模板對(duì)照(ntc，使用水代替pcr反應(yīng)中的核酸，其他的試劑按比例正常加入)，也可以是陰性樣本對(duì)照(如不表達(dá)靶基因的樣本)。陰性對(duì)照的作用是可以防止pcr檢測(cè)中因產(chǎn)物污染、試劑污染、樣本間交叉污染、樣本采集運(yùn)輸污染等問題而出現(xiàn)的假陽(yáng)性。

67、術(shù)語(yǔ)“dna芯片”也稱為基因芯片，通常是指以寡核苷酸或dna片段，有規(guī)律、高密度地固定排列在支持物(如玻璃片、硅片或纖維膜等)上制成陣點(diǎn)(spot)，然后按照堿基配對(duì)原則與待測(cè)dna樣品進(jìn)行雜交，再通過(guò)檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并借助計(jì)算機(jī)對(duì)各陣點(diǎn)信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和比較，從而對(duì)所測(cè)序列及功能進(jìn)行高通量、大規(guī)模的分析和研究。

68、術(shù)語(yǔ)“多重實(shí)時(shí)熒光定量pcr”通常是指融合了多重pcr和實(shí)時(shí)熒光定量pcr兩種方法，通過(guò)在相同反應(yīng)體系中擴(kuò)增多個(gè)dna片段，實(shí)現(xiàn)同時(shí)完成多個(gè)目標(biāo)基因的檢測(cè)。針對(duì)每一個(gè)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性探針，利用不同探針上標(biāo)記的熒光基團(tuán)，結(jié)合儀器對(duì)不同通道熒光的檢測(cè)能力實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。在多重實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)中，多個(gè)模板在相同條件下平行擴(kuò)增，每個(gè)擴(kuò)增子為其他擴(kuò)增子提供了一個(gè)內(nèi)部對(duì)照，便于鑒別潛在的pcr反應(yīng)失敗引起的假陰性問題。