本發(fā)明涉及xxxxx，特別是涉及基于xrcc3與xpc基因分析卵巢癌早期篩查方法。

背景技術(shù)：

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最具致命性的惡性腫瘤之一，早期診斷對(duì)提高患者生存率至關(guān)重要，研究表明，dna修復(fù)機(jī)制的異常與多種癌癥的發(fā)展密切相關(guān)，尤其是卵巢癌，xrcc3和xpc基因在dna修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中xrcc3參與同源重組修復(fù)，而xpc則在核苷酸切除修復(fù)中發(fā)揮重要作用，兩者的基因多態(tài)性可能影響個(gè)體對(duì)dna損傷的修復(fù)能力，從而增加患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)；

2、近年來(lái)，研究表明dna修復(fù)機(jī)制在卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用；dna修復(fù)基因如xrcc3和xpc在修復(fù)dna損傷中具有關(guān)鍵功能，涉及細(xì)胞對(duì)環(huán)境因素和內(nèi)源性損傷的反應(yīng)；xrcc3基因編碼的蛋白質(zhì)主要參與同源重組修復(fù)，負(fù)責(zé)修復(fù)雙鏈dna斷裂；而xpc基因編碼的蛋白質(zhì)則在核苷酸切除修復(fù)中發(fā)揮作用，負(fù)責(zé)識(shí)別并修復(fù)因紫外線和化學(xué)物質(zhì)引起的dna損傷；

3、這些基因的多態(tài)性可能導(dǎo)致修復(fù)能力的變化，從而影響個(gè)體對(duì)癌癥的易感性；例如，xrcc3基因的某些單核苷酸多態(tài)性(snp)已被證實(shí)與卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；類似地，xpc基因的多態(tài)性也與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)；盡管已有研究探討了xrcc3和xpc基因的多態(tài)性與卵巢癌之間的關(guān)系，但缺乏系統(tǒng)性的方法用于有效地檢測(cè)這些多態(tài)性，以作為早期篩查的生物標(biāo)志物；

4、現(xiàn)有的卵巢癌篩查方法多依賴于影像學(xué)檢查和ca-125標(biāo)志物檢測(cè)，但這些方法在早期檢測(cè)中的敏感性和特異性有限；

5、基于此，需基于xrcc3與xpc基因分析卵巢癌早期篩查方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：基于xrcc3與xpc基因分析卵巢癌早期篩查方法，包括以下步驟：

2、步驟一、從實(shí)驗(yàn)組-臨床卵巢癌患者和對(duì)照組-其他良性疾病就診患者中各收集外周血液樣本40例，為xrcc3和xpc基因檢測(cè)提供基礎(chǔ)樣本；

3、步驟二、使用dna提取試劑盒從收集到的血液樣本中提取全基因組dna，使用dnaclean&concentrator?tm-5試劑盒純化，將抑制因子和污染物去除，再通過(guò)nanodrop紫外分光光度計(jì)測(cè)定dna濃度，同時(shí)使用0.7％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，篩選合格dna樣本；

4、步驟三、準(zhǔn)備22k?human?genome?array芯片，所述芯片包含21522條oligo?dna探針，其中特異性探針用于識(shí)別xrcc3基因的a4541g、a17893g、t241m位點(diǎn)以及xpc基因的ala499val、lys939gln位點(diǎn)，每條探針特異性識(shí)別一個(gè)人類基因轉(zhuǎn)錄本，將實(shí)驗(yàn)組-臨床卵巢癌患者的mrna和正常對(duì)照組-其他良性疾病的mrna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，將cdna作為探針與芯片上的xrcc3和xpc特異性探針進(jìn)行雜交；

5、步驟四、對(duì)提取的dna樣本定量分析，標(biāo)準(zhǔn)化至50ng/μl，所需芯片分析的dna樣本量為200ng，在樣本中加入0.1n?naoh使dna變性為單鏈，便與芯片上的xrcc3和xpc基因特異性探針結(jié)合，隨后，將中和后的樣本加入全基因組擴(kuò)增試劑，在37℃恒溫條件下孵育過(guò)夜，使擴(kuò)增后的dna總量達(dá)到初始上樣量的2000-3000倍；

6、步驟五、擴(kuò)增后的dna樣本進(jìn)行可控的酶解處理，使片段化過(guò)程不損害xrcc3和xpc基因的完整性，片段化后，通過(guò)加入異丙醇沉淀，4℃離心以富集片段化的dna，隨后，在空氣中干燥并重懸于雜交緩沖液中；

7、步驟六、將重懸于雜交緩沖液中的dna樣本與已準(zhǔn)備好的芯片雜交，置于雜交爐內(nèi)反應(yīng)過(guò)夜，此時(shí)，片段化的dna與芯片上x(chóng)rcc3和xpc基因位點(diǎn)特異性探針的有效結(jié)合，芯片總共包含610000種微珠類型，其中每種微珠對(duì)應(yīng)檢測(cè)一個(gè)snp位點(diǎn)；

8、步驟七、清洗去除未雜交及非特異性雜交的dna，僅保留與xrcc3和xpc基因位點(diǎn)結(jié)合的dna，利用捕獲到的dna在芯片上進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，并在芯片上添加可檢測(cè)的標(biāo)簽基團(tuán)，以區(qū)分xrcc3和xpc基因中的不同樣本的snp類型，將反應(yīng)完成的芯片置于xc4試劑中包被，形成保護(hù)層以穩(wěn)定xrcc3和xpc基因的檢測(cè)信號(hào)；

9、步驟八、使用luxscan?10ka雙通道激光掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，激光激發(fā)芯片上單堿基延伸產(chǎn)物的熒光基團(tuán)，生成高分辨率的圖像，所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入luxscan3.0圖像分析軟件，分析oc組織與正常組織之間的熒光信號(hào)強(qiáng)度和比值，使用12個(gè)管家基因進(jìn)行均衡；

10、在數(shù)據(jù)分析中，所設(shè)定判定xrcc3和xpc基因差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)如下：

11、標(biāo)準(zhǔn)一：oc組織和正常組織的比值ratio需大于2.0或小于0.5，其基因表達(dá)變化在2倍以上，反映出顯著的差異；

12、標(biāo)準(zhǔn)二：oc組織和正常組織信號(hào)其中之一強(qiáng)度需大于800，或二者均需大于200，且顯性表達(dá)數(shù)據(jù)在所有樣本中能夠重復(fù)；

13、步驟九、在基因表達(dá)譜中選擇xrcc3和xpc基因中ratio值差異顯著的上調(diào)和下調(diào)基因各一條，利用rt-pcr技術(shù)驗(yàn)證，確認(rèn)xrcc3和xpc基因在卵巢癌患者中的表達(dá)差異。

14、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟三中，所述mrna的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用cbcscript逆轉(zhuǎn)錄酶，以保證逆轉(zhuǎn)錄效率和cdna的完整性，通過(guò)將從實(shí)驗(yàn)組-臨床卵巢癌患者和對(duì)照組-其他良性疾病就診患者收集的mrna混合，并根據(jù)cbcscript逆轉(zhuǎn)錄酶的用戶手冊(cè)中提供的反應(yīng)條件設(shè)置，包括適宜的溫度和時(shí)間，在反應(yīng)完成后，利用瓊脂糖凝膠電泳法確認(rèn)cdna的質(zhì)量，通過(guò)比較cdna的條帶大小與標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記，以驗(yàn)證完整性。

15、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟四中，加入全基因組擴(kuò)增試劑的濃度范圍為1-5μl，并保持反應(yīng)體系的體積在20-50μl，在擴(kuò)增過(guò)程中采用熱循環(huán)程序，包括以下階段：

16、變性階段：在95℃下保持30秒至1分鐘，使dna雙鏈完全分開(kāi)；退火階段：將溫度降至55℃-65℃，保持30秒至1分鐘，使引物與目標(biāo)序列特異性結(jié)合；延伸階段：將溫度設(shè)定在72℃，保持時(shí)間為30秒至1分鐘，利用taq?dna聚合酶對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增；

17、擴(kuò)增結(jié)束后通過(guò)光度計(jì)測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度，所獲得的dna樣本量滿足后續(xù)芯片分析所需的200ng標(biāo)準(zhǔn)。

18、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟五中，片段化后的dna樣本需經(jīng)過(guò)酶解處理，其酶的選擇包括限制性內(nèi)切酶或dna片段化酶，生成的dna片段在200-500bp范圍內(nèi)，在dna沉淀后，通過(guò)離心和洗滌去除未結(jié)合的試劑和酶，得到高純度的片段化dna樣本，并重懸于適當(dāng)?shù)碾s交緩沖液中。

19、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟六中，片段化后的dna樣本經(jīng)過(guò)變性處理，使其轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂溞问?，此時(shí)，dna樣本中的序列與芯片上位點(diǎn)特異的50個(gè)堿基探針進(jìn)行退火結(jié)合，每個(gè)微珠bead上連接著不同的50個(gè)堿基序列，芯片總共包含610000種微珠類型，每種微珠對(duì)應(yīng)檢測(cè)一個(gè)snp位點(diǎn)。

20、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟七中，將芯片放入xc4試劑中進(jìn)行包被，使芯片的表面包裹上一層粘性透明液體，在芯片外形成保護(hù)層。

21、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟八中，將經(jīng)過(guò)雜交和延伸反應(yīng)處理的芯片放入掃描儀中，通過(guò)激光激發(fā)芯片上單堿基延伸產(chǎn)物的熒光基團(tuán)，掃描儀獲取由熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)，并生成高分辨率的圖像數(shù)據(jù)，所得的圖像數(shù)據(jù)直接導(dǎo)入luxscan3.0圖像分析軟件處理與分析，提取每個(gè)樣本的snp分型數(shù)據(jù)。

22、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述步驟九中，根據(jù)目標(biāo)基因的序列信息設(shè)計(jì)特異性引物，引物的tm值相近，在在rt-pcr反應(yīng)中，設(shè)定初始變性溫度為95℃，退火溫度為60℃，延伸溫度為72℃，每個(gè)循環(huán)設(shè)定為30秒，pcr產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離，確認(rèn)擴(kuò)增的特異性和大小，通過(guò)比較擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶強(qiáng)度及位置，確認(rèn)上調(diào)和下調(diào)基因的表達(dá)差異。

23、根據(jù)本發(fā)明提供的具體實(shí)施例，本發(fā)明公開(kāi)了以下技術(shù)效果：

24、本發(fā)明采用snp基因芯片技術(shù)系統(tǒng)地研究xrcc3和xpc基因的多態(tài)性與卵巢癌發(fā)病之間的關(guān)系，通過(guò)高通量基因檢測(cè)，能夠高效識(shí)別與卵巢癌相關(guān)的特定多態(tài)性位點(diǎn)，從而為卵巢癌的早期篩查提供更為精準(zhǔn)的生物標(biāo)志物，此外，本發(fā)明的實(shí)施方法確保了樣本的高質(zhì)量獲取和數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性，具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、靈敏度高優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)xrcc3和xpc基因的特定多態(tài)性位點(diǎn)，有助于早期診斷卵巢癌。