本發(fā)明屬于包含核酸的測定方法，具體涉及與番茄果實重量相關(guān)的kasp分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、番茄（ solanum?lycopersicum?l.）是屬于茄科茄屬的一種一年生或多年生草本植物。番茄主要的食用部位是果實，果實中含有豐富的可溶性糖、類胡蘿卜素、維生素c、番茄紅素以及有機酸等多種物質(zhì)，具有抗氧化、減緩衰老、增強免疫力、預(yù)防癌癥等諸多功效。

2、番茄果重是一個多基因控制的數(shù)量性狀，在發(fā)育過程中易受到遺傳、激素、外部環(huán)境、人為栽培措施等多方面影響，表型變異豐富，是控制著番茄的大小和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，經(jīng)過不斷地馴化改良，番茄果重從醋栗番茄的1-2克，到櫻桃番茄的10-40克，再到栽培番茄的幾百克，最大的差異達百倍以上。

3、目前，通過分子遺傳學(xué)研究報道的控制番茄果實重量的數(shù)量性狀位點（quantitative?trait?locus，qtl）很多，其中編碼細胞數(shù)目調(diào)控家族成員之一的 fw2.2，編碼一種p450酶的kluh?的同源基因 fw3.2、編碼細胞大小調(diào)控因子的 fw11.3、編碼slclv3的 fas(fasciated)、編碼slwus的 lc(locule?number)和編碼油菜素內(nèi)酯羥化酶的 globe等6個被精細定位和克隆。又例如yu?ning等的研究通過qtl-seq在f2群體中鑒定到 fw6.3是一個主效qtl（fine?mapping?of?fw6.3,?a?major-effect?quantitative?trait?locus?thatcontrols?fruit?weight?in?tomato.?plants,?2023,12(11):2065.）。

4、全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome?wide?association?study，gwas）是利用case群體與control群體之間單核苷酸多態(tài)性（snp）位點的比較，發(fā)現(xiàn)與性狀相關(guān)聯(lián)的基因或基因組區(qū)域。番茄是研究植物果實發(fā)育的模式植物，自花授粉，變異類型多種多樣，連鎖不平衡衰退率比較大，可為番茄的全基因組關(guān)聯(lián)分析提供大量的遺傳變異。利用gwas更加準確地挖掘番茄種質(zhì)資源中與重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的優(yōu)良基因。

5、競爭性等位變異特異性pcr（kompetitive?allele?specific?pcr，kasp）是一種基于熒光的同質(zhì)基因分型技術(shù)，以傳統(tǒng)pcr和熒光檢測為基礎(chǔ)，具有靈活、簡單、高通量等優(yōu)點。利用gwas挖掘目標(biāo)性狀相關(guān)位點后，結(jié)合kasp分子標(biāo)記技術(shù)輔助育種進行選育，能顯著提高育種者選育品種效率，破解傳統(tǒng)分子標(biāo)記檢測通量低，無法實現(xiàn)大規(guī)模篩選的難題，減輕田間工作量，促進相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

6、專利文獻cn?117683938?b、cn?118406794?a分別公開與番茄果實寬度、長度緊密連鎖的kasp分子標(biāo)記?，F(xiàn)有技術(shù)中未見針對番茄果實重量的kasp分子標(biāo)記的報道，番茄果實重量作為多基因控制的數(shù)量性狀，發(fā)掘與之相關(guān)的kasp分子標(biāo)記對于解析番茄果實發(fā)育的調(diào)控機制以及番茄的分子育種研究具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種與番茄果實重量相關(guān)的分子標(biāo)記，基因分型效果好，用于篩選鑒定不同番茄果實重量的材料，可在苗期鑒定果實重量，輔助選擇育種。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明運用全基因組關(guān)聯(lián)分析法獲得了若干與番茄果實重量相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（snp）位點，進一步設(shè)計kasp引物，并在番茄群體中進行分型鑒定，獲得一個分型效果好的分子標(biāo)記。本發(fā)明以篩得的snp位點作為檢測靶點應(yīng)用于篩選或鑒定番茄果實重量，所述snp位點為番茄基因組第9號染色體全長序列的第336003位，存在t＞c的多態(tài)性；所述番茄基因組序列號為gcf_000188115.5。

4、具體的，序列號為gcf_000188115.5的番茄基因組第9號染色體全長序列的第336003位的堿基包括t和c兩種狀態(tài)，當(dāng)基因分型為tt時，番茄果實重量較大；基因分型為cc時，番茄果實重量較小。

5、進一步的，所述應(yīng)用包括：以待測番茄植株基因組dna為模板，利用特異性檢測所述單核苷酸多態(tài)性位點的引物組進行pcr反應(yīng)，根據(jù)相應(yīng)配對引物擴增的pcr產(chǎn)物判斷基因分型，進而預(yù)測番茄果實重量。利用該方法可在番茄苗期或更早期進行種質(zhì)篩選。

6、本發(fā)明根據(jù)上述snp位點開發(fā)了與番茄果實重量相關(guān)的kasp分子標(biāo)記，以snp位點為坐標(biāo)，截取基因組上下游的核苷酸片段。根據(jù)kasp分子標(biāo)記中snp位點設(shè)計引物組，用于特異性檢測番茄基因組中所述的snp位點。

7、進一步的，所述kasp分子標(biāo)記為以所述單核苷酸多態(tài)性位點為坐標(biāo)，選取上下游各40-100bp的核苷酸序列。

8、進一步的，所述kasp分子標(biāo)記的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。

9、本發(fā)明還可以以上述snp位點作為檢測靶點開發(fā)相應(yīng)的檢測試劑盒，因此，本發(fā)明提供了一種篩選或鑒定番茄果實重量的檢測試劑盒，所述試劑盒包括用于特異性擴增所述的kasp分子標(biāo)記的引物組。

10、擴增所述kasp分子標(biāo)記的引物組包括兩條特異性正向引物和一條通用反向引物。特異性正向引物1的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，特異性正向引物2的核苷酸序列如seqid?no.3所示，通用反向引物的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

11、進一步的，特異性正向引物1和特異性正向引物2的5’端分別連接兩個不同的熒光標(biāo)簽序列。本發(fā)明在兩條特異性引物上標(biāo)記不同的熒光標(biāo)簽，通過鑒別熒光標(biāo)簽可實現(xiàn)不同基因分型的鑒定。

12、進一步的，兩條特異性正向引物的5’端分別標(biāo)記fam基團、hex基團。

13、所述試劑盒還包含pcr反應(yīng)液，所述pcr反應(yīng)液包含pcr緩沖液、taqdna聚合酶和dntp混合液。pcr反應(yīng)液中各組分之間的用量關(guān)系為常規(guī)pcr條件下的比例，對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)知識。

14、本發(fā)明還提供了一種篩選或鑒定不同番茄品種果實重量的方法，包括以下步驟：

15、(1)提取待測番茄植株的基因組dna；

16、(2)以番茄植株的基因組dna為模板，利用擴增所述的kasp分子標(biāo)記的引物組進行pcr擴增；

17、(3)對pcr產(chǎn)物進行檢測，對待測番茄進行基因分型，進而判斷果實重量。

18、進一步的，步驟(1)中，提取待測番茄品種幼苗葉片的基因組dna。

19、進一步的，步驟(2)中，pcr反應(yīng)體系為：dna模板?0.8?μl，2×kasp?master?mix0.75?μl，kasp?assay?mix?0.05?μl。其中kasp?assay?mix的配制為將濃度為100?μm的正向引物1、正向引物2、反向引物和ddh2o以12:12:30:46的比例進行混合。

20、pcr反應(yīng)程序為：第一步：94℃預(yù)變性15?min；第二步：94℃變性20?s，61~55℃退火延伸60?s，10個循環(huán)，每個循環(huán)降低0.6℃；第三步：94℃變性20?s，55℃退火延伸60?s，共26個循環(huán)。

21、本發(fā)明采用特異性檢測第336003位snp的引物對進行pcr擴增，研究表明，該位點作為檢測靶點在番茄群體中驗證獲得了高度一致且界限清晰的群體分型效果，分型效率為95.7%。

22、具體的，采用核苷酸序列如seq?id?no.2-4所示的引物組進行pcr擴增；當(dāng)鑒定基因分型為cc時，判斷番茄果實重量較小；當(dāng)鑒定基因分型為tt時，判斷番茄果實重量較大。

23、本發(fā)明具備的有益效果：

24、（1）本發(fā)明運用全基因組關(guān)聯(lián)分析法獲得了與番茄果實重量相關(guān)的snp位點fw-336003，進一步開發(fā)了相關(guān)的kasp分子標(biāo)記和kasp引物，在231份番茄群體中驗證獲得了高度一致且界限清晰的群體分型效果，分型效率為95.7%。

25、（2）本發(fā)明利用kasp分子標(biāo)記用于番茄果實重量的分型，可以將不同基因型的番茄材料明顯分開，且不同基因型材料的果實重量差異達到了極顯著差異水平，tt基因型材料比cc基因型材料的果實重量更重。在選育過程中，根據(jù)其基因型判斷果實重量的等位變異，可在苗期便快速選擇出符合育種目標(biāo)大小的優(yōu)良群體，實現(xiàn)育種群體的早期篩選，加速番茄品種的分子育種進程。