和藤 黃八疊球菌）和真菌（酵母、核盤菌、灰霉菌、稻瘟病菌）的生長。本研宄為利用生物信息 手段和基因工程技術(shù)大規(guī)模鑒定新植物來源抗菌肽奠定了基礎(chǔ)，提供了一種新的途徑。此 外BnLTPl可作為生物試劑噴施于植物表面提高植物對真菌病害的抗性，同時，還可以作為 一個新分子標(biāo)記用于輔助抗病育種，還可以作為一個新基因源用于植物基因工程，以培育 抗病轉(zhuǎn)基因植物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是在于提供了一個具有對真菌和細(xì)菌抑菌活性的油菜抗菌肽 BnLTPl，其序列為SEQ ID NO. 2所示。該抗菌肽共93個核苷酸，編碼31個氨基酸，其中4 個半胱氨酸形成兩個分子內(nèi)二硫鍵，對于穩(wěn)定抗菌肽的結(jié)構(gòu)起到了重要的作用。該抗菌肽 可以增強(qiáng)植物對腐生營養(yǎng)型真菌核盤菌、灰霉菌以及稻瘟病菌的抗性。
[0015] 本發(fā)明的另一個目的在于提供了油菜抗菌肽BnLTPl對應(yīng)的核苷酸序列，優(yōu)選序 列為S EQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
[0016] 本發(fā)明還有一個目的在于提供了油菜抗菌肽BnLTPl基因的合成方法，方法簡單。 利用DNAWorks軟件工具，通過密碼子優(yōu)化設(shè)計引物序列，采用Overlap-PCR技術(shù)合成BnLT Pl基因序列。
[0017] 本發(fā)明的再一個目的是在于提供了油菜抗菌肽BnLTPl的制備方法，采用豬瘟病 毒蛋白突變體EDDIE為融合蛋白；在包涵體蛋白純化、復(fù)性后，EDDIE重新正確折疊，恢復(fù)其 自剪切能力，在特異位點Cysl68和169處把C端融合的抗菌肽剪切下來，從而獲得不增加 任何多余氨基酸的抗菌肽產(chǎn)物。
[0018] 本發(fā)明的最后一個目的在于提供了油菜抗菌肽BnLTPl在制備抗菌藥物中的應(yīng) 用，該抗菌肽可以同時對藤黃八疊球菌，大腸桿菌，酵母菌，核盤菌，灰霉菌及稻瘟病菌產(chǎn)生 良好的抑制效果，并能增強(qiáng)植物對腐生營養(yǎng)型真菌核盤菌、灰霉菌以及稻瘟病菌的抗性，同 時還可以應(yīng)用于生物防治和抗病育種。
[0019] 為了完成上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0020] 為了獲得本發(fā)明，申請人對油菜（甘藍(lán)型油菜Brassica napus)基因組中抗菌核 病的相關(guān)基因以及現(xiàn)有的抗菌肽數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了深入全面的分析比對和預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一 個新的轉(zhuǎn)脂蛋白類抗菌肽基因，通過對該基因的體外合成和誘導(dǎo)表達(dá)、蛋白純化后進(jìn)行了 活性分析，發(fā)現(xiàn)該基因不僅具有抗細(xì)菌活性還具有抗真菌活性。本發(fā)明開發(fā)了一個增強(qiáng)植 物對真菌抗性的BnLTPl基因，BnLTPl基因表達(dá)的抗菌肽在抑菌活性試驗中不僅具有抗細(xì) 菌活性還有抗真菌活性（包括酵母、核盤菌、灰霉菌和稻瘟病菌），預(yù)示著該基因在油菜抗 菌核病、大豆灰斑病和水稻稻瘟病育種中具有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用前景。
[0021] 油菜抗菌肽基因 BnLTPl的獲得：
[0022] 目前申請人實驗室已開展了油菜葉片，角果的表達(dá)譜測序，獲得大量ESTs數(shù) 據(jù)信息。同時通過白菜、甘藍(lán)和油菜和全基因組測序項目，構(gòu)建了它們的基因組序列 信息庫(http://www. ocri-genomicls. org/bolbase) 〇 利用這些序列信息與專門的 抗菌肽數(shù)據(jù)庫，如 ANTIMIC(Brahmachary M, Krishnan SPT, Koh JLY, et al. ANTIMIC:a database of antimicrobial sequences. Nucleic Acids Research, 2004, 32:D586-D589， 以下相同），APD(Wang Z，Wang GS.APD:the Antimicrobial Peptide Database-Nucleic Acids Research，2004,32:D590_D592， 以下 相同）AProBOittpV/ercbinfoL ucd. ie/APPDb/，以下相同），PhytAMP(H ammami R, Hamida JB, Vergoten G, et al. Phytamp: a database dedicated to plant antimic robial peptides. Nucleic Acids Res. 2009, 37:D963-D968,以下相同）等進(jìn)行BLAST比對（核苷酸相似度>90%即 Identity>90% )，獲得大批量的與已知抗菌肽序列有類似結(jié)構(gòu)特征的預(yù)選基因。隨后對 這些預(yù)選基因的蛋白序列（Vector NTI10)和二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)（nnpredict:ht tp://www. cmpharm.ucsf.edu/nomi/nnpredict predictionprotein，以下相同）進(jìn)行預(yù)測和分析，從 而建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖，利用二級結(jié)構(gòu)和功能對所篩選出的抗菌肽進(jìn)行蛋白質(zhì)家族的分 類建庫，從而最終獲得潛在的新抗菌肽基因。編號為EV53256,命名為BnLTPl?；?BnL TPl 核苷酸序列為SEQ ID NO. 3所示，抗菌肽BnLTPl的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。一種 體外合成油菜BnLTPl基因的制備方法，步驟如下：油菜BnLTPl基因的密碼子優(yōu)化與體外合 成
[0023] 根據(jù)BnLTPl基因的DNA序列，設(shè)計引物序列，共合成引物6條覆蓋BnLTPl全長的 引物，分別為 BnPEV53256_l，BnPEV53256_2, BnPEV53256_3, BnPEV53256_4, backbo neF 和 backboneR。引物序列如表I所示，
[0024] 表 loverlap PCR 引物序列
[0025]
【主權(quán)項】
1. 一種分離的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ ID NO. 2所示。
2. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)對應(yīng)的基因。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其序列為SEQ ID NO. 3所示。
5. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的抗菌藥物為抗核盤菌藥物、抗灰霉 菌藥物、抗稻瘟病菌藥物、抗大腸桿菌藥物、抗藤黃八疊球菌藥物或抗畢赤酵母藥物。
7. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在增強(qiáng)植物對腐生營養(yǎng)型真菌抗 性用的應(yīng)用，所述的真菌為核盤菌、灰霉菌或稻瘟病菌。
8. 權(quán)利要求1所述蛋白的制備方法，包括以下步驟： 1) 融合表達(dá)載體EDDIE-BnLTPl的構(gòu)建 利用 30abackbone-F: TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC和 30abackbone-R: GCAGCTGGTCACCCACAGCG引物，通過反向 PCR 擴(kuò)增，將 pET30a/His-EDDIE-GFP 載體線性化； 將回收到的pET30a/His-EDDIE-GFP線性化載體片段與SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，同 時轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLIO-Gold菌株，通過體內(nèi)定點同源重組，將基因連接到表達(dá)載體 沒沿花-^^上，獲得目的基因融合表達(dá)載體EDDIE-BnLTPl , 2) 抗菌肽BnLTPl體外誘導(dǎo)表達(dá)與分離純化 將測序正確融合表達(dá)載體EDDIE-BnLTPl質(zhì)粒，用熱激法轉(zhuǎn)化到現(xiàn)^力感受態(tài)細(xì)胞 中，獲得EDDIE-BnLTPl融合表達(dá)工程菌現(xiàn)^力/利用常規(guī)方式在LB液體培養(yǎng)基 中培養(yǎng)并誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，獲得的菌體破碎離心，上清純化后，即得目的蛋白抗菌肽BnLTPl， 其序列為SEQ ID NO. 2所示。
9. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2所述的基因在制備同時抑制藤黃八疊球菌， 大腸桿菌，酵母菌，核盤菌，灰霉菌及稻瘟病菌藥物中的應(yīng)用。
10. 利用overlap PCR方法合成權(quán)利要求3所述基因序列的引物： BnPEV53256_l ：CGCTGTGGGTGACCAGCTGCGGCGCTGACCTGCGGCACCGTGAACAGC ； BnPEV53256_2 ：CCCCCCTGGGTAATATAGCCAATGCACGGCGCCACATTGCTGTTCACGGTGCCG ； BnPEV53256_3 ：GGCTATATTACCCAGGGGGGACCGCTGCCCGGAGCGTGCTGCACCGGCTAAAGC ； BnPEV53256_4 ：GGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGCTATTCAGTTTGCTTTAGCCGGTGCAGC ； backboneF :TGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCC ; backboneR :GCAGCTGGTCACCCACAGCG。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種油菜抗菌肽BnLTP1及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種油菜抗菌肽BnLTP1，其序列為SEQ ID NO.2所示。通過overlap PCR方法完成該基因的人工合成，將合成的抗菌肽基因克隆到pET30a/His-EDDIE-GFP表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行體外表達(dá)，獲得不增加任何多余氨基酸的抗菌肽產(chǎn)物。抑菌活性檢測結(jié)果表明抗菌肽BnLTP1對細(xì)菌和真菌都具有較強(qiáng)的抑菌活性。離體葉片涂抹接菌實驗證實 BnLTP1 能夠顯著增強(qiáng)植物對腐生營養(yǎng)型真菌：核盤菌、灰霉菌、稻瘟病菌的抗性。BnLTP1能夠作為生防制劑用于菌核病、灰霉病以及稻瘟病的防治中，也可以作為抗性標(biāo)記用于油菜抗病品種的選育。
【IPC分類】A01P3-00, C12N15-11, C12N15-29, A01N43-36, C07K14-415, C12N15-70, A01P1-00
【公開號】CN104530205
【申請?zhí)枴緾N201510050902
【發(fā)明人】劉勝毅, 董彩華, 曹慧慧, 黃軍艷, 劉越英, 童超波, 程曉輝, 柯濤
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月30日