提取茶葉核酸的試劑及用該試劑提取茶葉核酸的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種破除茶葉細(xì)胞壁，提取茶葉 DNA和RNA的試劑及使用該試劑提取茶葉DNA和RNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 優(yōu)良品種的茶樹(shù)都是長(zhǎng)期精心選育而成的，傳統(tǒng)的茶樹(shù)品種的鑒定是根據(jù)其物理 特性（例如芽葉肥瘦、大小、葉色、葉片厚薄等）和鮮葉化學(xué)成分進(jìn)行鑒別。隨著分子診斷 技術(shù)的發(fā)展，使聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)、探針雜交、核酸測(cè)序等分子生物學(xué)方法直接檢測(cè)茶 樹(shù)和茶葉的遺傳特性和基因表達(dá)情況成為可能。通過(guò)對(duì)茶葉DNA的檢測(cè)可以判斷茶葉遺傳 特性，而對(duì)茶葉RNA的檢測(cè)，可以判斷茶葉的基因表達(dá)情況，以推測(cè)茶葉的性狀。利用遺傳 背景相同的茶葉，在不同地域或接受不同培養(yǎng)方法，其生長(zhǎng)情況會(huì)發(fā)生變化，茶葉性狀也發(fā) 生變化。分子診斷技術(shù)的第一步就是模板核酸的制備，即樣品中核酸的提取，這直接影響著 檢測(cè)的結(jié)果。
[0003] 茶葉中含有的次生代謝物質(zhì)最為復(fù)雜，特別是對(duì)DNA提取影響極大的多酚類物質(zhì) 在茶葉中的含量是所有植物中最高的，因此，茶葉樣品中核酸的提取和純化一直是耗時(shí)，繁 瑣的過(guò)程。雖然目前有分別提取茶葉DNA和RNA的方法，但是這些方法的原理和操作過(guò)程 各不相同，沒(méi)有一個(gè)公認(rèn)的可以同時(shí)對(duì)茶葉的DNA和RNA進(jìn)行高效的共同提取的方法。
[0004] 眾所周知，茶葉由于細(xì)胞壁比較難以破裂，因此在其核酸提?。ㄓ绕涫荝NA)方面， 效果一直不很理想。目前茶葉的核酸提取主要采用裂解細(xì)胞后提取核酸的方法，其中常用 的破壁方法主要包括：超聲研磨，加入表面活性劑或變性劑，以及一些提取試劑盒等。目前 被廣泛采用的市場(chǎng)銷售的RNA提取試劑盒價(jià)格昂貴，操作步驟繁瑣，并且提取效果也并不 理想。因此，如何從茶葉中高效、快捷的共同提取DNA和RNA核酸，已成為了目前分子診斷 技術(shù)等技術(shù)在茶葉品種、品質(zhì)鑒定領(lǐng)域中應(yīng)用的一個(gè)瓶頸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的多酚類物質(zhì)影響茶葉破壁及RNA 的提取的缺陷，提供一種破除茶葉細(xì)胞壁，提取茶葉DNA和RNA的試劑及使用該試劑提取茶 葉DNA和RNA的提取方法。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種提取茶葉核酸的試劑，包括試 劑A、試劑B、試劑C、試劑D;
[0007]其中，試劑A包括Tris、EDTA、3-[(3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、 十二烷基肌氨酸鈉、0 -巰基乙醇以及作為溶劑的水；其中Tris的濃度為5-10mM;EDTA的 濃度為5-10mM;3-[(3_膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸的體積百分含量濃度為 0. 05% -0. 2%、十二烷基肌氨酸鈉體積百分含量濃度為0. 05% -0. 2% ; 0 -巰基乙醇的體 積百分含量濃度為0. 1-0. 5% ;
[0008] 試劑B包括水飽和酚、吡咯烷酮、乙醇；水飽和酚、吡咯烷酮、乙醇的體積比為 (99-98):1:1 ；
[0009] 試劑C包括氯仿和異戊醇；氯仿和異戊醇的體積比為25:1 ;
[0010] 試劑D為無(wú)水乙醇。
[0011] 本發(fā)明所述的提取茶葉核酸的試劑，其中，所述試劑A的pH值為7. 2-7. 8。
[0012] 本發(fā)明所述的提取茶葉核酸的試劑，其中，所述試劑B的pH值為5-8。
[0013] 本發(fā)明所述的提取茶葉核酸的試劑，其中，所述試劑A按照如下方法制備：將十二 烷基肌氨酸鈉、0 _巰基乙醇、Tris、EDTA、3-[ (3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸 和水混合，得到試劑A。
[0014] 本發(fā)明所述的提取茶葉核酸的試劑，其中，所述試劑B按照如下方法制備：將水飽 和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到試劑B。
[0015] 本發(fā)明所述的提取茶葉核酸的試劑，其中，所述試劑C按照如下方法制備：將氯仿 和異戊醇混合，得到試劑C。
[0016] 本發(fā)明還包括一種茶葉核酸的提取方法，利用上述的提取茶葉核酸的試劑進(jìn)行提 取，包括如下步驟：
[0017] S1、茶葉的研磨：將茶葉磨碎得到茶葉粉末；
[0018] S2、去除茶葉的細(xì)胞壁，得到去細(xì)胞壁的茶葉裂解液：使用試劑A與茶葉粉末混 勻，再加入試劑B，混勻，進(jìn)行裂解反應(yīng)，得到反應(yīng)液；將反應(yīng)液離心收集上層水相，即得到 去除細(xì)胞壁的茶葉裂解液；
[0019] S3、純化去細(xì)胞壁的茶葉裂解液：在去除細(xì)胞壁的茶葉裂解液中加入等體積的試 劑C，進(jìn)行純化反應(yīng)，得到純化裂解液；
[0020] S4、得到茶葉的DNA和RNA:在純化裂解液中加入等體積的試劑D，混勻，離心得到 茶葉細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA。
[0021] 本發(fā)明所述的茶葉核酸的提取方法，其中，所述茶葉、試劑A和試劑B的配比為 1ug-lg：400y1 ：400y1〇
[0022] 本發(fā)明所述的茶葉核酸的提取方法，其中，S2中所述的裂解反應(yīng)時(shí)間為 30-60min〇
[0023] 本發(fā)明所述的茶葉核酸的提取方法，其中，S3中所述純化反應(yīng)溫度為60-70°C。
[0024] 實(shí)施本發(fā)明的一種破除茶葉細(xì)胞壁，提取茶葉DNA和RNA的試劑及使用該試劑提 取茶葉DNA和RNA的提取方法，具有以下有益效果：
[0025] (1)通過(guò)調(diào)整試劑A的配方比以及在試劑A中加入抗氧化劑等手段，減少茶葉中多 酚、多糖類物質(zhì)對(duì)核酸抽提的影響，進(jìn)而可從茶葉中高效、快捷地提取DNA和RNA核酸（可 去掉核酸）。
[0026] (2)該茶葉的DNA和RNA提取方法操作簡(jiǎn)單，成本非常低，提取效果好。
【附圖說(shuō)明】
[0027] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中：
[0028] 圖1為本發(fā)明較佳實(shí)施例1中茶葉提取的核酸與CTAB法提取的核酸的甲醛變性 膠電泳對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0030] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0031] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0032] 下述實(shí)施例所用的試劑：
[0033] 試劑六包括1^8、￡014、3-[(3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷 基肌氨酸鈉、0 -巰基乙醇；Tris在試劑A中的濃度為5-10mM;EDTA在試劑A中的濃度為 5-10mM;3-[ (3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸鈉在試劑A中的 體積百分含量濃度均為0. 05% -0. 2% ; 0 -巰基乙醇在試劑A中的體積百分含量濃度為 0. 1-0. 5%；
[0034] 所述試劑A按照如下方法制備：將十二烷基肌氨酸鈉、0 -巰基乙醇、Tris、EDTA、 3_[ (3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸和水混合，得到試劑A;所述試劑A的pH值 為7. 2-7. 8。試劑A的配方組分中，除了Tris外都有抗氧化的作用，這個(gè)組分的作用主要 是針對(duì)如何減少多酚類物質(zhì)而設(shè)想的。
[0035] 試劑B包括水飽和酚、吡咯烷酮、乙醇；水飽和酚、吡咯烷酮、乙醇的體積比為 (99-98):1:1 ；
[0036] 所述試劑B按照如下方法制備：將水飽和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到試劑B;其 中，所述試劑B的pH值為5-8。因未飽和的酚會(huì)吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化 發(fā)黃，而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)，故在制備酚飽和液時(shí) 要加入一特殊物質(zhì)，以防止酚氧化。
[0037] 試劑C包括氯仿和異戊醇；氯仿和異戊醇的體積比為25:1 ;所述試劑C按照如下 方法制備：將氯仿和異戊醇混合，得到試劑C;氯仿可去除脂肪，使更多蛋白質(zhì)變性，從而提 高提取效率。異戊醇則可減少操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。
[0038] 試劑