件下，15000rpm進(jìn)行離心 30分鐘。離心結(jié)束后，離心管中溶液自然分層，小心將上層水相用移液槍吸出轉(zhuǎn)移至新的 1. 5ml的離心管中，盡量避免吸入中間的蛋白層和下層有機(jī)相溶劑，得到去細(xì)胞壁的茶葉裂 解液。
[0085]S3、純化去細(xì)胞壁的茶葉裂解液：
[0086] 在吸出的去細(xì)胞壁的茶葉裂解液中加入400ul的試劑C，將其在渦旋震蕩儀上劇 烈震蕩。將裝有混合物的離心管在在4°C的條件下，15000rpm進(jìn)行離心10分鐘。離心結(jié)束 后，離心管中的溶液自然分層，小心將上層水相用移液槍吸出轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管 中，盡量避免吸入中間的蛋白層和下層有機(jī)相溶劑，得到去純化的除細(xì)胞壁茶葉裂解液。
[0087] S4、得到茶葉的DNA和RNA
[0088] 在純化的除細(xì)胞壁茶葉裂解液中加入2倍體積的試劑D，-20°C保溫2小時(shí)，4°C 下15000rpm離心lOmin，棄掉上清。沉淀用lml的70%乙醇洗絳后，4°C下12000rpm離心 5min，將乙醇棄掉。將沉淀在室溫條件下自然樣品3。
[0089]實(shí)施4
[0090] 茶葉：新鮮茶葉
[0091] 試劑：試劑A:3-[(3_膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸鈉 在試劑A中的體積百分含量濃度均為0. 12 %;Tris在試劑A中的濃度為8mM;EDTA在試劑 A中的濃度為8mM;試劑A的pH值為7. 6;
[0092] 試劑B :水飽和酚、吡咯烷酮、乙醇的體積比為98. 5:1:1 ;
[0093] 試劑C :氯仿和異戊醇的體積比為25:1 ;
[0094] 試劑D:無水乙醇；
[0095] 75% 乙醇。
[0096]1、茶葉DNA和RNA的提取
[0097]S1、茶葉的研磨：用研缽將茶葉磨碎。
[0098]S2、去除茶葉的細(xì)胞壁，得到去細(xì)胞壁的茶葉裂解液：
[0099] 取50mg茶葉粉末裝入1. 5ml的離心管中，加入400ul的試劑A，用移液槍將沉淀 物重懸，使充分混合在試劑A中。然后在混合物中加入400ul的試劑B，在渦旋器上劇烈震 蕩3分鐘，在震蕩過程中按緊離心管的蓋子，防止混合物漏出。劇烈震蕩結(jié)束后，將離心管 放置于65°C的震蕩儀中，溫育1個(gè)小時(shí)，在此期間每間隔30秒劇烈震蕩5秒鐘。將裝有裂 解液離心管在冰上進(jìn)行冰浴5分鐘（0°C)，然后將離心管在2°C的條件下，12000rpm進(jìn)行離 心8分鐘。離心結(jié)束后，離心管中溶液自然分層，小心將上層水相用移液槍吸出轉(zhuǎn)移至新的 1. 5ml的離心管中，盡量避免吸入中間的蛋白層和下層有機(jī)相溶劑，得到去細(xì)胞壁的茶葉裂 解液。
[0100]S3、純化去細(xì)胞壁的茶葉裂解液：
[0101] 在吸出的去細(xì)胞壁的茶葉裂解液中加入400ul的試劑C，將其在渦旋震蕩儀上劇 烈震蕩。將裝有混合物的離心管在在3°C的條件下，12000rpm進(jìn)行離心10分鐘。離心結(jié)束 后，離心管中的溶液自然分層，小心將上層水相用移液槍吸出轉(zhuǎn)移至新的1.5ml的離心管 中，盡量避免吸入中間的蛋白層和下層有機(jī)相溶劑，得到去純化的除細(xì)胞壁茶葉裂解液。
[0102] S4、得到茶葉的DNA和RNA
[0103] 在純化的除細(xì)胞壁茶葉裂解液中加入2倍體積的試劑D，-20°C保溫2小時(shí)，2°C 下12000rpm離心15min，棄掉上清。沉淀用lml的70%乙醇洗絳后，4°C下12000rpm離心 5min，將乙醇棄掉。將沉淀在室溫條件下自然干燥，加入50ul純水，將沉淀充分溶解，得到 茶葉的DNA和RNA樣品4。
[0104] 檢測茶葉的DNA和RNA的純度
[0105] 1、紫外分光光度計(jì)定量核酸：
[0106] 首先分別用溶解核酸的試劑對紫外分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零，調(diào)零后分別取2ul采用 研磨法、CTAB法提取的茶葉DNA和RNA以及實(shí)施例1-4提取的茶葉DNA和RNA加到紫外分 光光度計(jì)上，點(diǎn)擊測定按鈕進(jìn)行核酸濃度的測定。
[0107] 結(jié)果如表1所示：
[0108] 表1為茶葉提取的核酸濃度、260/280和260/230數(shù)值
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提取茶葉核酸的試劑，其特征在于，包括試劑A、試劑B、試劑C、試劑D ; 其中，試劑A包括Tris、EDTA、3-[ (3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二 烷基肌氨酸鈉、0 -巰基乙醇以及作為溶劑的水；其中Tris的濃度為5-10mM ;EDTA的濃 度為5-10mM;3-[(3-膽固醇氨丙基）二甲基氨基]-1-丙磺酸的體積百分含量濃度為 0. 05% -0. 2%、十二烷基肌氨酸鈉體積百分含量濃度為0. 05% -0. 2% ; 0 -巰基乙醇的體 積百分含量濃度為0. 1-0. 5% ; 試劑B包括水飽和酚、吡咯烷酮、乙醇；水飽和酚、吡咯烷酮、乙醇的體積比為 (99-98):1:1 ； 試劑C包括氯仿和異戊醇；氯仿和異戊醇的體積比為25:1 ; 試劑D為無水乙醇。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取茶葉核酸的試劑，其特征在于，所述試劑A的pH值為 7. 2-7. 8。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取茶葉核酸的試劑，其特征在于，所述試劑B的pH值為 5-8 〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取茶葉核酸的試劑，其特征在于，所述試劑A按照如下方 法制備：將十二烷基肌氨酸鈉、0-巰基乙醇、!'1^4〇14、3-[(3-膽固醇氨丙基）二甲基氨 基]-1-丙磺酸和水混合，得到試劑A。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取茶葉核酸的試劑，其特征在于，所述試劑B按照如下方法 制備：將水飽和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到試劑B。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取茶葉核酸的試劑，其特征在于， 所述試劑C按照如下方法制備：將氯仿和異戊醇混合，得到試劑C。
7. -種茶葉核酸的提取方法，其特征在于，利用如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的提取 茶葉核酸的試劑進(jìn)行提取，包括如下步驟： 51、 茶葉的研磨：將茶葉磨碎得到茶葉粉末； 52、 去除茶葉的細(xì)胞壁，得到去細(xì)胞壁的茶葉裂解液：使用試劑A與茶葉粉末混勻，再 加入試劑B，混勻，進(jìn)行裂解反應(yīng)，得到反應(yīng)液；將反應(yīng)液離心收集上層水相，即得到去除細(xì) 胞壁的茶葉裂解液； 53、 純化去細(xì)胞壁的茶葉裂解液：在去除細(xì)胞壁的茶葉裂解液中加入等體積的試劑C， 進(jìn)行純化反應(yīng)，得到純化裂解液； 54、 得到茶葉的DNA和RNA :在純化裂解液中加入等體積的試劑D，混勻，離心得到茶葉 細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的茶葉核酸的提取方法，其特征在于，所述茶葉、試劑A和試劑 B 的配比為 1 y g-lg :400 y 1 :400 y 1。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的茶葉核酸的提取方法，其特征在于，S2中所述的裂解反應(yīng)時(shí) 間為 30-60min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的茶葉核酸的提取方法，其特征在于，S3中所述純化反應(yīng)溫度 為 60-70。。。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取茶葉核酸的試劑，包括試劑A、試劑B、試劑C、試劑D；試劑A包括Tris、EDTA、3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸鈉、β-巰基乙醇以及作為溶劑的水；試劑B包括水飽和酚、吡咯烷酮、乙醇；試劑C包括氯仿和異戊醇；試劑D為無水乙醇。通過調(diào)整試劑A的配方比以及在試劑A中加入抗氧化劑等手段，減少茶葉中多酚、多糖類物質(zhì)對核酸抽提的影響，進(jìn)而可從茶葉中高效、快捷地提取DNA和RNA核酸(可去掉核酸)。該茶葉的DNA和RNA提取方法操作簡單，成本非常低，提取效果好。
【IPC分類】C12N15-10
【公開號】CN104531681
【申請?zhí)枴緾N201410856863
【發(fā)明人】譚嘉力, 張娟
【申請人】廣東粵檢生物科技有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月31日