口的瞬間快速刺入卵母細(xì)胞卵周隙，等細(xì)胞進(jìn)入胚胎后迅速移出injection。
[0014] 2. 3重構(gòu)胚的融合與激活：將移核完畢的卵母細(xì)胞平鋪于加滿激活液（配方：0. 3M 甘露醇，0. 5mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸，1.OmMCaCl2 ? 2H20, 0.ImMMgCl2 ? 6H20)的融合槽中 (BTX，槽寬0. 5mm或1mm)，電融合儀為BLS(CF-150B)。用針撥動(dòng)卵母細(xì)胞將卵母細(xì)胞與供 體細(xì)胞接觸面垂直于場(chǎng)強(qiáng)方向，供體細(xì)胞面向正極方向。30min后觀察融合率，未融合的進(jìn) 行二次融合。將融合后的卵母細(xì)胞放入38°C、5% 0)2中培養(yǎng)，48h后達(dá)4-細(xì)胞期，6d后觀 察重組囊胚的發(fā)育情況。
[0015] 2. 4轉(zhuǎn)H0XA10基因克隆胚胎的移植：重組胚胎達(dá)到2-4細(xì)胞期后，挑選形態(tài)和發(fā) 育較好的胚胎進(jìn)行移植。每頭受體移植約250枚胚胎，共移植5頭母豬。胚胎移植后35d、 70d進(jìn)行B超妊娠檢測(cè)。
[0016] 3、轉(zhuǎn)基因豬分子生物學(xué)鑒定
[0017] 轉(zhuǎn)基因小豬出生飼養(yǎng)至斷奶后，取其尾組織及耳組織樣，提取組織基因組DNA(或 稱總DNA)，利用PCR、Real-timePCR、染色體步移方法鑒定轉(zhuǎn)基因小豬是否為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因豬 (即目的基因成功插入轉(zhuǎn)基因豬基因組中）。
[0018] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0019] (1)本發(fā)明易行，操作簡(jiǎn)便，通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞篩選技術(shù)篩選出表達(dá)豬H0XA10 基因的豬成纖維細(xì)胞系，將表達(dá)豬H0XA10基因的豬成纖維細(xì)胞系人工移植到受體卵母細(xì) 胞中獲得重構(gòu)胚胎，進(jìn)而將重構(gòu)胚移植到受體母豬輸卵管壺腹部-峽部結(jié)合處。待獲得克 隆豬后，通過(guò)PCR、Real-timePCR、染色體步移方法檢測(cè)H0XA10基因的表達(dá)以及插入位點(diǎn)， 從而獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因豬。相比與傳統(tǒng)的陽(yáng)性檢測(cè)方法，本發(fā)明效率高而成本低，陽(yáng)性檢測(cè)時(shí) 間短，適合批量生產(chǎn)，為培育高繁殖力豬提供了良好素材。
[0020] (2)本發(fā)明首次構(gòu)建了雌激素誘導(dǎo)型H0XA10基因的轉(zhuǎn)基因豬，該轉(zhuǎn)基因豬不僅為 研宄H0XA10基因提高繁殖力的機(jī)理提供素材，同時(shí)也為揭示豬H0XA10基因其他功能提供 了動(dòng)物模型。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 序列表SEQIDN0:1是重組的載體pc3. 1-H0XA10-DNA的全部序列，序列長(zhǎng)度 為8365bp，其中在該序列的234-1301bp處是插入的部分H0XA10基因的啟動(dòng)子序列，從第 1302-3853bp處為插入的部分H0XA10基因序列。
[0022] 序列表SEQIDN0:2是實(shí)施例中引物KZQ-F/R擴(kuò)增的核苷酸片段，序列長(zhǎng)度為 154bp，包含部分pcDNA3.lplus載體序列與部分H0XA10基因啟動(dòng)子序列，其中l(wèi)-17bp是上 游引物，136-154bp是下游引物。
[0023] 序列表SEQIDNO:3是實(shí)施例中引物KDZ-F/R擴(kuò)增片段，序列長(zhǎng)度為293bp，包含 部分H0XA10基因序列與部分pcDNA3.lplus載體序列，其中l(wèi)-19bp為上游引物，275-293bp 為下游引物。
[0024] 序列表SEQIDN0:4是實(shí)施例中引物ZT-F/R擴(kuò)增的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為 293bp。包含部分pcDNA3.1plus載體序列，其中l(wèi)-18bp為上游引物，326-343bp為下游引 物。
[0025] 序列表SEQIDN0:5是應(yīng)用于實(shí)施例中引物ZT1-F/R擴(kuò)增的序列，序列長(zhǎng)度為 173bp，包含部分載體pc3. 1-H0XA10-DNA核苷酸序列，其中l(wèi)-20bp為上游引物，155-173bp 為下游引物。
[0026] 序列表SEQIDN0:6是實(shí)施例中引物TFRC-F/R擴(kuò)增的TFRC基因部分核苷酸序 列，序列長(zhǎng)度為l〇2bp其中l(wèi)-20bp為上游引物，82-102bp為下游引物。
[0027] 序列表SEQIDNO:7利用染色體步移方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因小豬（來(lái)自2號(hào)細(xì)胞系）中 插入的外源載體pc3. 1-H0XA10-DNA所在染色體的部分核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1092bp。
[0028] 序列表SEQIDNO:8是利用染色體步移方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因小豬（來(lái)自3號(hào)細(xì)胞系） 中插入的外源載體pc3. 1-H0XA10-DNA所在染色體的部分核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1192bp。
[0029] 序列表SEQIDNO:9是利用染色體步移方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因小豬（來(lái)自3號(hào)細(xì)胞系） 中插入的外源載體pc3. 1-H0XA10-DNA所在染色體的部分核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1269bp。
[0030] 序列表SEQIDNO:10是利用染色體步移方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因小豬（來(lái)自3號(hào)細(xì)胞系） 中插入的外源載體pc3. 1-H0XA10-DNA所在染色體的部分核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1229bp。
[0031] 序列表SEQIDNO:11是利用染色體步移方法擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因小豬（來(lái)自3號(hào)細(xì)胞系） 中插入的外源載體pc3. 1-H0XA10-DNA所在染色體的部分核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為1272bp。
[0032] 圖1 :載體pc3. 1-H0XA10-DNA示意圖。該載體是在pcDNA3.lplus載體基礎(chǔ)上改造 而成的，其中環(huán)狀載體示意圖為pcDNA3.lplus，在位于載體pcDNA3.Iplus229bp處的Mlul 酶切位點(diǎn)與912bp處的Hindlll酶切位點(diǎn)間插入H0XA10基因啟動(dòng)子片段，在位于912bp處 的Hindlll酶切位點(diǎn)與位于922bp處的Kpnl酶切位點(diǎn)間插入H0XA10基因部分DNA序列， 即得到改造后的載體pc3. 1-H0XA10-DNA示意圖。
[0033] 圖2 :BglII線性化pc3. 1-H0XA10-DNA示意圖。圖中標(biāo)記說(shuō)明：泳道1標(biāo)明線性為 Bglll線性化后的質(zhì)粒DNA;泳道2標(biāo)明環(huán)狀為環(huán)狀的質(zhì)粒DNA。
[0034] 圖3 :轉(zhuǎn)H0XA10基因的大白豬胎兒成纖維細(xì)胞陽(yáng)性克隆篩選與鑒定示意圖。圖3 中的A圖是正常原代培養(yǎng)的大白豬胎兒成纖維細(xì)胞示意圖；圖3中的B圖是轉(zhuǎn)染H0XA10基 因的大白豬公豬成纖維細(xì)胞，通過(guò)硫酸鹽（G418)篩選獲得的單克隆細(xì)胞示意圖；圖3中的 C圖是單克隆細(xì)胞的PCR鑒定圖，從上往下依次為特異性引物KZQ-F/R、KDZ-F/R和ZT-F/R 的擴(kuò)增結(jié)果（單克隆細(xì)胞株編號(hào)1-7號(hào)）。
[0035] 圖4 :表達(dá)H0XA10基因的重構(gòu)胚胎示意圖。將表達(dá)H0XA10基因的大白公豬胎兒成 纖維細(xì)胞系作為核供體，移植入去核的卵母細(xì)胞中融合形成重構(gòu)胚體外培養(yǎng)，其中圖4中 的A圖為融合48小時(shí)后的胚胎，圖4中的B圖為融合6天后的胚胎。
[0036] 圖5 :轉(zhuǎn)H0XA10基因豬的PCR鑒定示意圖。圖中標(biāo)記說(shuō)明：轉(zhuǎn)基因小豬（編號(hào) 2-1、2-2、2-3、3-1、3-2、3-3、3-4、3-5)出生后采取耳朵及尾部組織樣提取基因組DNA，取 50ngDNA為模板，KZQ-F/R、KDZ-F/R、ZT-F/R三對(duì)引物，PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95°C5min， 1個(gè)循環(huán)；變性94°C30s、退火60°C30s、延伸72°C20s，28個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min，l個(gè) 循環(huán)。1.5%瓊脂糖凝膠，110￥/2〇111；[11，861-代(1染色51]1；[11顯示結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照為以質(zhì)粒 pc3. 1-H0XA10-DNA為模板擴(kuò)增的結(jié)果，陰性對(duì)照為以非轉(zhuǎn)基因豬為模板的擴(kuò)增結(jié)果，所有 模板均取50ng進(jìn)行擴(kuò)增。
[0037] 圖6 :轉(zhuǎn)H0XA10基因豬的拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線。以含有10°個(gè)、10 1個(gè)、10 2個(gè)、10 3個(gè)和 104個(gè)轉(zhuǎn)H0XA10基因拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Real-timePCR得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為拷貝 數(shù)的log值（以10為底），橫坐標(biāo)為樣品插入的pc3. 1-H0XA10-DNA擴(kuò)增的C(t)值減去相 應(yīng)的內(nèi)參基因擴(kuò)增的C(t)值，得到的校正后的AC(t)值。
[0038] 圖7 :本發(fā)明制備的重組載體pc3. 1-H0XA10-DNA的全部序列，其中單下劃線部分 是H0XA10基因的啟動(dòng)子序列，雙下劃線為插入的部分H0XA10基因序列，未標(biāo)注的為原載體 pcDNA3.lplus的核苷酸序列。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 實(shí)施例1利用過(guò)表達(dá)H0XA10基因制備轉(zhuǎn)基豬的方法
[0040] 本試驗(yàn)所用試劑包括：細(xì)胞試驗(yàn)所用試劑除特殊說(shuō)明外均購(gòu)自Sigma公司，質(zhì)粒 提取試劑盒及基因組DNA提取試劑盒除特殊說(shuō)明外均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公 司，所有限制性核苷酸內(nèi)切酶除特殊說(shuō)明外均購(gòu)自NEB公司。
[0041] 步驟1.pc3. 1-H0XA10-DNA載體的酶切驗(yàn)證與線性化
[0042] 采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（貨號(hào)： DP117)提取質(zhì)粒pc3. 1-H0XA10-DNA(見圖1)并測(cè)量濃度。該載體質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu) 建的質(zhì)粒：將位于載體pcDNA3.Iplus229bp處的Mlul酶切位點(diǎn)與