912bp處的Hindlll酶切 位點間插入H0XA10基因啟動子片段見序列表SEQIDNO:1中的234-1301bp處的啟動子 序列，或參見圖7所示的單下劃線部分的序列即為本發(fā)明的啟動子序列），位于912bp處的 Hindlll酶切位點與位于922bp處的Kpnl酶切位點間插入H0XA10基因部分DNA序列（序 列表SEQIDN01 雙下劃線部分）。取pc3. 1-H0XA10-DNA質(zhì)粒DNA150ng，Ahdl和SspI分 別酶切后凝膠電泳檢測條帶是否與預(yù)期相符。將驗證正確的質(zhì)粒用內(nèi)切酶Bglll酶切，將 質(zhì)粒線性化（圖2)。電泳檢測酶切條帶是否與預(yù)期相符，采用天根DNA純化回收試劑盒將 線性化質(zhì)?；厥?。
[0043] 步驟2.建立大白豬胎兒成纖維細胞系
[0044] 用常規(guī)胰酶消化法分離大白豬胎兒成纖維細胞：取33日齡大白豬（采自天津益 利來養(yǎng)殖有限公司）胎兒用預(yù)先預(yù)熱（38. 5°C)的含抗青鏈霉素的生理鹽水或磷酸緩沖液 (簡稱PBS，購自Gibco公司，貨號：10010-023)洗去血液，用眼科剪和鑷子將胎兒的頭、內(nèi) 臟及四肢棄去后將剩余的肌肉組織剪至1mm3以下。加入胰酶消化液8ml(購自Gibco公司， 貨號：25300-062)，用移液槍將肌肉組織小塊及細胞消化液移入滅菌的15ml試管中，擰緊 試管蓋，于38. 5°C振動消化30min。消化完畢后，靜置5-6分鐘，將上部渾濁液輕輕倒入另 一個試管中，下部沉淀用8ml胰酶消化液重新懸浮，重復(fù)上述步驟1次。將兩次收集的上部 渾濁液lOOOrpm離心5min，棄上清。用PBS洗滌1次，lOOOrpm離心5min，棄上清。用10ml 細胞培養(yǎng)基DMEM(購自Gibco公司，貨號：11995-065)將細胞懸浮至50ml細胞培養(yǎng)瓶中， 置于38.5°0、5%0)2、100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（見圖3中的六圖）。
[0045] 步驟3.過量表達H0XA10基因的轉(zhuǎn)基因細胞系的建立
[0046] 3. 1大白豬胎兒成纖維細胞的性別鑒定
[0047] 采用細胞DNA提取試劑盒（購自：天根生化科技（北京）有限公司，貨號：DP304)提取大白豬胎兒成纖維細胞基因組DNA，采用尹智等（尹智等：應(yīng)用雙重PCR 技術(shù)鑒定豬胎兒性別及其細胞系建立.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報2008,9:49-52)利用哺乳 動物Y染色體短臂上近常染色體區(qū)域的性別決定區(qū)（Sexdeterminingregionof Y_chromosome，SRY)的特異性片段（Genebank登錄號：U49860)設(shè)計引物進行擴增（SRY-F: 5' -TAGACGCTTTCATTGTGTGGTC-3'，SRY-R:5' -GCCAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3'），用于鑒定成 纖維細胞來源的性別。根據(jù)本實施例的需要，申請人選擇雄性（大白豬公豬）胎兒成纖維 細胞作為核供體細胞。
[0048] 3. 2細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
[0049] 選取大白豬公豬胎兒成纖維細胞進行純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前將細胞接種至6孔板中， 待細胞匯合度達70% -80%時進行轉(zhuǎn)染。將脂質(zhì)體溶于終體積為250y1的無血清無雙抗的 細胞培養(yǎng)基DMEM(購自Gibco公司，貨號：11995-065)中靜置5分鐘，靜置期間將線性化的 載體質(zhì)粒加入終體積為250y1的無血清無雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM中，隨后將質(zhì)粒 與脂質(zhì)體輕輕混勻，室溫孵育20min。將待轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液吸干，加入250y1 質(zhì)粒與DMEM混合液、250y1脂質(zhì)體與DMEM混合液，再加入lml無血清無雙抗的DMEM，放入 培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染4-6小時，然后換新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24小時后觀察轉(zhuǎn)染效率。
[0050] 3. 3供體細胞篩選及陽性細胞擴大培養(yǎng)
[0051] 利用800yg/ml硫酸鹽（簡稱G418,購自Sigma公司，貨號：A1720)連續(xù)篩選 7-8天后，可見明顯單克隆圈（圖3中的B圖）。隨后將G418濃度逐漸降低至200yg/ml 并維持培養(yǎng)8-15天后，進行單克隆細胞的挑取。單克隆細胞的挑取采用醫(yī)用采血針，將 醫(yī)用采血針拉至200-300ym口徑備用。將需挑出的單克隆細胞用記號筆圈出，用移液槍 吸除培養(yǎng)液，PBS(購自Gibco公司，貨號：10010-023)洗去殘留培養(yǎng)基，經(jīng)胰酶消化后，迅 速用采血針將單克隆吸出并置于含200yg/mlG418細胞培養(yǎng)基（購自Gibco公司，貨號： 11995-065)的48孔板中。輕輕吹打細胞，第二天更換新鮮維持培養(yǎng)液（購自Gibco公司，貨 號：11995-065)，以后每3天更換一次維持培養(yǎng)液，當(dāng)細胞達90%匯合時，傳代培養(yǎng)及凍存。 隨后進行陽性單克隆細胞的PCR鑒定，鑒定引物采用三對特異性引物：pc3. 1-H0XA10-DNA 重組載體中跨部分pcDNA3.lplus載體序列與部分H0XA10基因啟動子序列的特異性 引物KZQ-F:5' -TTGGAGGTCGCTGAGTAGT-3'，KZQ-R:5' -CCGAGGCTATGACAAGAAC-3'、 跨H0XA10基因部分DNA序列與pcDNA3.lplus部分載體序列的特異性引物KDZ-F: 5' -TTCTCCTCCCTCTGTCATC-3'，KDZ-R:5' -CACCCCCCAGAATAGAATG-3'、pcDNA3. 1 部分載體序 列的特異性引物ZT-F:5' -TCTGATGCCGCCGTGITC-3'，ZT-R:5' -TACGTGCTCGCTCGATGC-3'， 鑒定引物KZQ-F/R、KDZ-F/R、ZT-F/R對應(yīng)的擴增序列見序列表SEQIDNO2、3、4。PCR鑒 定試驗同時以野生型（即非轉(zhuǎn)基因豬）大白豬基因組DNA為陰性對照，水為空白對照， pc3. 1-H0XA10-DNA質(zhì)粒為陽性對照進行PCR擴增檢測，得到表達豬H0XA10基因的轉(zhuǎn)基因 豬成纖維細胞，用于后續(xù)核移植的核供體。圖3中的C圖為本實施例得到的7株細胞系的 PCR檢測結(jié)果（細胞株編號1-7號），該結(jié)果表明7株細胞系利用3對特異性引物均能擴增 出正確條帶，確認為轉(zhuǎn)基因陽性細胞系。
[0052] 步驟4.轉(zhuǎn)H0XA10基因克隆胚胎的制備
[0053] 4. 1豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)
[0054] 利用帶有18號針頭的10ml-次性注射器采集3-6_卵泡中的卵泡液。將采集好 的卵泡液放入15ml離心管中，靜止10分鐘后棄去上清，用采卵液（命名PVA-TL-HEPES)洗 兩遍。收集形態(tài)規(guī)則，細胞質(zhì)均勻，外圍有3-5層卵丘細胞緊密包裹的卵丘細胞-卵母細胞 復(fù)合體（簡稱COCs)，置于38. 5°C、5%C02、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42-44小時。而后將 卵母細胞用200-300y1的移液槍轉(zhuǎn)移到含0. 03%透明質(zhì)酸酶的1. 5ml離心管中，反復(fù)吹打 100次左右脫去卵丘細胞并在4X10倍體視顯微鏡鏡下觀察有無第一極體存在。以第一極 體排出、細胞膜完整、圓形、卵周隙可見的卵母細胞作為卵母細胞成熟的標(biāo)準(zhǔn)。
[0055] 4. 2卵母細胞去核
[0056] 將Holder、injection及極體處于同一水平面，然后將injection針尖快速刺破透 明帶后收針，輕柔地破開細胞膜，然后緩慢回針，使針口正對極體且位于透明帶間隙內(nèi)，緩 緩吸取1/5-1/4的細胞質(zhì)并同時吸走極體，沿橫軸方向快速出針，迅速推動油壓泵，使吸取 物順著透明帶涌出。
[0057] 4. 3供體細胞的準(zhǔn)備
[0058] 供體細胞移核前準(zhǔn)備：檢查用于移核的細胞的生長狀態(tài)，待細胞完全匯合后利用 胰酶將細胞消化，消化后的細胞利用50y1-200y1胚胎操作液H199 (配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)基 Mediuml99 中添加 30mMNaCl，2.9mMIfepes緩沖液，0.6mMNaHC03,50yg/ml青霉素，60yg/ ml鏈霉素，3mg/ml牛血清白蛋白BSA)清洗并重懸，置于顯微操作盤中。本實施例選用建立 的7株轉(zhuǎn)H0XA10基因細胞系中的2號細胞系與3號細胞系作為供體細胞。
[0059] 4. 4 移核
[0060] 將顯微操作針調(diào)節(jié)到最佳位置，選取中等大小、活力較好的細胞約30-50個吸入 injection中。Holder固定胚胎后，調(diào)節(jié)焦距，使胚胎與injection在同一平面，稍微給 injection-點向外打細胞的力，待細胞將要出injection口的瞬間快速刺入胚胎卵周隙， 待細胞進入胚胎后迅速移出injection。
[0061] 4. 5重構(gòu)胚的融合與激活
[0062] 用針撥動卵母細胞將卵母細胞與供體細胞接觸面垂直于場強方向，供體細胞面向 正極方向，融合參數(shù)為1. 3kv/mm、30us、2次脈沖。30min后觀察融合率，未融合的進行二次 融合。將融合后的卵母細胞放入38°C、5% 0)2中培養(yǎng)，48h后觀察卵裂率（見圖4中的A 圖），6天后觀察囊胚發(fā)育情況（見圖4中的B圖）。
[0063] 步驟5.轉(zhuǎn)H0XA10基因克隆胚胎的移植及轉(zhuǎn)基因豬的獲取
[0064] 當(dāng)克隆胚胎體達