Pkd1基因突變的檢測試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于檢測遺傳性多囊腎病相 關(guān)的PKD1基因突變的引物組、試劑盒以及使用該引物組和試劑盒檢測PKD1基因突變的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 1 ?疾病及基因背景
[0003] 常染色體顯性遺傳性多囊腎?。╝dultpolycystickidneydisease，APKD，又稱 成人多囊腎?。┦且环N常見的先天遺傳疾病，成人多囊腎病常于青中年時期被發(fā)現(xiàn)，也可 在任何年齡發(fā)病，為常見的遺傳性多發(fā)性囊腫性腎病，發(fā)病率約為1/1，000-1/400,約占末 期腎臟病的5%。該疾病于中年時期在腎臟會慢慢形成囊腫及腫大，最后導(dǎo)致腎衰竭。常染 色體顯性多囊腎的診斷主要依靠影像學(xué)或分子遺傳學(xué)檢測來明確。對于影像學(xué)檢測，在年 齡30歲以上的患者或PKD1突變的年輕患者，檢測的敏感度接近100% ;而在30歲以下的 PKD2突變年輕患者，檢查的敏感度僅有67%。嬰兒或者兒童在影像學(xué)檢查中沒有看到明顯 的囊腫。常染色體顯性多囊腎患者雖然在胎兒時期和/或出生時就已經(jīng)發(fā)生基因突變，但 卻在以后的生活中才出現(xiàn)多囊腎病的表現(xiàn)，許多患者在30歲前常因B超結(jié)果表現(xiàn)正常而漏 診。因此，連鎖分析或直接突變篩查等分子遺傳檢測有臨床價值，通過基因檢測提早診斷成 人多囊腎病成為新的研宄熱點之一。此外，對胎兒的多囊腎病產(chǎn)前基因篩查還可以進(jìn)行早 期診斷，有助于早期處理并發(fā)癥。
[0004] 可能存在3種基因引起成人多囊腎病，按發(fā)現(xiàn)先后分別命名為PKD1、PKD2、PKD3， 其中PKD1及PKD2基因已被克隆，成人多囊腎病基因突變后，引起多囊蛋白結(jié)構(gòu)和功能異 常，繼而導(dǎo)致囊腫發(fā)生及進(jìn)行性長大。PKD1是造成成人多囊腎的最主要病因，約占85%， 且癥狀嚴(yán)重，而PKD2基因僅占10-15%，且癥狀較輕，基因外顯子較少且無特殊結(jié)構(gòu)，此處 不做探討。PKD1基因定位于16pl3. 3-pl3. 12,長52kb，含46個外顯子，其中外顯子1-34為 多拷貝區(qū)，外顯子35-46為單拷貝區(qū)，分別占基因70%和30%的區(qū)域，蛋白質(zhì)產(chǎn)物由4302 個氨基酸殘基構(gòu)成的一種糖蛋白，稱為多囊蛋白-1。
[0005] 到目前為止，全世界已發(fā)現(xiàn)的PKD1基因突變位點有868個[該數(shù)據(jù)源于PKDB數(shù) 據(jù)庫201405版本，網(wǎng)址11?口:/如1?113.111&70. 6(111/]，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)？1(01基因突變沒有明顯的熱點 區(qū)域，而且該數(shù)據(jù)庫多為非中國人群突變，因此有大量中國人群特有的突變尚未發(fā)現(xiàn)，為了 提高對成人多囊腎病的診斷并進(jìn)一步研宄PKD1基因突變與成人多囊腎病的關(guān)系，除了利 用已知的PKD1基因突變位點輔助診斷之外，還需要盡可能找出PKD1基因上之前未知的基 因突變，供醫(yī)師和研宄者研宄這些突變與疾病之間的關(guān)聯(lián)性。
[0006] PKD1基因中80%以上的突變均在占基因70%區(qū)域的多拷貝區(qū)，在染色體其它部 位還存在6個PKD1基因的同源序列區(qū)，均為同源性高達(dá)97. 8%的假基因，嚴(yán)重干擾PKD1真 基因的檢測。為了獲得真基因特異的突變，避免把假基因上的差異位點誤判為真基因上的 致病突變，需要得到真基因的特異序列，因此在真基因與假基因序列有差異的位置設(shè)計真 基因特異的引物，但由于假基因相似性太高，且假基因數(shù)量多，導(dǎo)致可供設(shè)計特異引物位置 很少，距離遠(yuǎn)，因此需要進(jìn)行5000bp甚至更長的長片段PCR。
[0007] 長片段PCR是指擴(kuò)增長度大于3kb的PCR，與一般的短片段PCR的區(qū)別在于，其受 DNA模板的二級結(jié)構(gòu)、引物的特異性和退火溫度、以及不理想的循環(huán)條件等因素的影響遠(yuǎn)大 于短片段擴(kuò)增，導(dǎo)致其擴(kuò)增難度大，特別是在長片段的PCR擴(kuò)增中，常常會發(fā)生DNA脫嘌呤 作用，而模板DNA上的一個單獨的損害就足以使PCR酶反應(yīng)停頓，導(dǎo)致反應(yīng)失敗，因此擴(kuò)增 穩(wěn)定性很低，條件摸索非常困難，對于特定的引物和模板需要小心選擇反應(yīng)體系以使得能 夠穩(wěn)定進(jìn)行長片段PCR反應(yīng)。在PKD1的長片段PCR中由于引物必須選擇真假基因差異位 點上，而且要求是盡量靠近引物3'末端才能提高擴(kuò)增真基因特異性，因此引物設(shè)計受到非 常大的限制，可選擇的余地非常少，只能通過調(diào)整擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件來提高擴(kuò)增成功率， 因此反應(yīng)條件的優(yōu)化至關(guān)重要。每個長片段PCR可能都有自己特異的擴(kuò)增條件，目前國內(nèi) 外針對PKD1長片段擴(kuò)增的文獻(xiàn)中均用到至少三種以上的反應(yīng)條件來才能完成PKD1所有長 片段PCR，由于每個條件需要用到一臺PCR儀，每進(jìn)行一次長片段PCR都需要七到十個小時， 因此需要大量的PCR儀同時進(jìn)行，或者需要大量的時間來輪換進(jìn)行，加上實驗的不穩(wěn)定性， 因此需要耗費大量的人力物力和時間，效率低下，難以大規(guī)模的應(yīng)用。
[0008] 長片段PCR擴(kuò)增完成后，傳統(tǒng)的方案都是通過Sanger法進(jìn)行測序，該方法被認(rèn)為 是測序的金標(biāo)準(zhǔn)，但在進(jìn)行PKD1檢測時有較大的局限性，即一次的測序長度小于800bp，因 此需要先采用巢式PCR擴(kuò)增出目的外顯子，再進(jìn)行Sanger法測序獲取目標(biāo)序列。但由于 PKD1基因過長，外顯子多達(dá)46個，因此進(jìn)行巢式PCR的次數(shù)和測序的次數(shù)過多，成本高，且 效率較低。雖然近年來開發(fā)出初篩方案，即巢式PCR產(chǎn)物先經(jīng)過SSCP技術(shù)或DHPLC技術(shù) 進(jìn)行初篩，這兩種技術(shù)能夠降低成本，快速的檢測出是否存在突變，再對存在突變的區(qū)域用 Sanger法測序確認(rèn)突變。但是由于技術(shù)本身原理所致，準(zhǔn)確性不高，有較高的漏檢率。而且 由于無法分辨基因中的多態(tài)，因此需要進(jìn)行Sanger法測序的數(shù)量也不少。因此效率和準(zhǔn)確 性仍然是局限應(yīng)用范圍的最大原因。
[0009] AdrianY.Tan等的方法（參見AdrianY.Tanetal.，Moleculardiagnosis ofautosomaldominantpolycystickidneydiseaseusingnext-generation sequencing,TheJournalofMolecularDiagnostics, 2014,Vol. 16,No. 2,pp216-228 ;以 下稱AdrianY.Tan等的方法）公開了一種通過高通量測序?qū)ΤＨ旧w顯性多囊腎病進(jìn)行 分子診斷的方法，其中采用長片段PCR結(jié)合高通量測序的方法檢測PKD1基因整個外顯子編 碼區(qū)，剪接位點區(qū)域及大部分5'和3'側(cè)翼區(qū)的基因序列上的突變。但是，本申請人發(fā)現(xiàn)，在 該文章公開的方法中，部分引物長片段擴(kuò)增后仍不能有效排除假基因的干擾，且引物穩(wěn)定 性仍然不理想，而且需要經(jīng)過3次PCR反應(yīng)條件之后才能完成整個基因的擴(kuò)增，用時較長， 效率較低。該方法采用的是IlluminaMiseq測序儀進(jìn)行檢測，該測序儀需要5到10天才 能測序完成，效率較低。而且，由于PKD1基因1號外顯子序列的GC含量大于85%，導(dǎo)致1 號外顯子測序質(zhì)量較差。
[0010] 因此，本領(lǐng)域仍然需要對PKD1基因突變進(jìn)行更高效、準(zhǔn)確的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明利用PKD1基因及其6個假基因的的序列比對的保守信息設(shè)計特異性引物， 采用統(tǒng)一的擴(kuò)增反應(yīng)條件，進(jìn)行長片段PCR擴(kuò)增出PKD1基因的特異性片段產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn) 物酶切打斷后富集建庫，并進(jìn)行高通量測序，獲得除外顯子1之外的全部外顯子及大部分 內(nèi)含子的全部序列，隨后通過生物信息學(xué)分析排除假基因位點干擾，獲得PKD1真基因的突 變，并確保檢測的特異性。
[0012] 由于PKD1基因1號外顯子序列的GC含量大于85%，而對于GC含量較高的區(qū)域進(jìn) 行高通量測序時，要