高于該擴增區(qū)域內(nèi)的平均值的離群點的突變位點，這些相當于突 變位點所對應的突變被判定為PKD1真基因突變。
[0059] 在一些實施方案中，所述"突變比例"由高通量測序結果中的突變堿基覆蓋深度除 以總覆蓋深度獲得，其中"突變"是指樣品測序結果與PKD1參考基因相比的突變。
[0060] 本發(fā)明的方法與以往的PKD1基因突變檢測方法相比，具有以下優(yōu)點：
[0061] 1)擴增產(chǎn)物覆蓋PKD1基因全長近80%，檢測范圍全面，可以檢測PKD1基因的除 外顯子1之外的全外顯子和大部分內(nèi)含子，覆蓋已報道的90%以上的致病位點，具體如下 表所示：
[0062]
【主權項】
1. 用于通過長片段PCR和高通量測序技術檢測PKDl基因突變的引物組，包括下述引 物： 用于擴增PKD1基因外顯子2-7的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO: 1和 SEQ ID N0:2 所示； 用于擴增PKDl基因外顯子8-12的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4 所示； 用于擴增PKDl基因外顯子13-21的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO: 5和 SEQ ID NO:6 所示； 用于擴增PKDl基因外顯子22-34的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO: 7和 SEQ ID NO:8 所示；和 用于擴增PKDl基因外顯子35-46的引物，其正向引物和反向引物分如SEQ ID NO:9和 SEQ ID NO: 10 所示。
2. 用于通過長片段PCR和高通量測序技術檢測PKDl基因突變的試劑盒，包含權利要求 1的引物組中的一對或多對引物。
3. 權利要求2的試劑盒，還包含W下一種或多種試劑： 用于從樣品提取基因組DNA的試劑； 利用所述引物進行長片段PCR反應的試劑； 用于處理擴增產(chǎn)物W使得擴增產(chǎn)物能用于高通量測序技術中的試劑；W及 用于對處理后的擴增產(chǎn)物進行高通量測序的試劑； 優(yōu)選其中所述利用所述引物進行長片段PCR反應的試劑DNA聚合酶、緩沖液和dNTP混 合物； 更優(yōu)選所述DNA聚合酶為TAKARA LA DNA聚合酶； 更優(yōu)選所述緩沖液為10 X Buffer II。
4. 一種用于通過長片段PCR和高通量測序技術檢測PKDl基因突變的檢測反應體系，包 含權利要求1的引物組中所包含的任何一對引物。
5. 權利要求4的檢測反應體系，還包含模板DNA、DNA聚合酶、緩沖液和dNTP混合物， 其中DNA聚合酶優(yōu)選為TAKARA LA DNA聚合酶，其中更優(yōu)選在50 y 1的所述檢測反應體 系中包含>l〇〇ng的DNA模板、上下游引物各2yl、TAKARA LA DNA聚合酶0. 5yl、10X Buffer II 5 y 1，dNTP 混合物 8 y 1。
6. -種用于非診斷目的的體外檢測PKDl基因突變的方法，包括W下步驟： (1) 使用權利要求1的引物組或權利要求2或3任一項的試劑盒或權利要求4或5任 一項的檢測反應體系通過長片段PCR擴增PKD1基因； (2) 對步驟（1)獲得的擴增序列進行高通量測序； (3) 將步驟（2)獲得的測序結果與PKD1基因參考序列比對，確定突變位點； (4) 通過生物信息學分析排除假基因位點干擾，確定PKD1真基因突變位點。
7. -種用于非診斷目的的體外PKD1基因分析方法，包括W下步驟： (1) 使用權利要求1的引物組或權利要求2或3任一項的試劑盒或權利要求4或5任 一項的檢測反應體系通過長片段PCR擴增PKD1基因； (2) 對步驟（1)獲得的擴增序列進行高通量測序； (3) 將步驟（2)獲得的測序結果與PKDl基因參考序列比對，確定突變位點； (4) 通過生物信息學分析排除假基因位點干擾，確定真基因突變位點。
8. -種檢測PKD1基因上的新突變位點的方法，包括W下步驟： (1) 使用權利要求1的引物組或權利要求2或3任一項的試劑盒或權利要求4或5任 一項的檢測反應體系通過長片段PCR擴增PKD1基因； (2) 對步驟（1)獲得的擴增序列進行高通量測序； (3) 將步驟（2)獲得的測序結果與PKD1基因參考序列比對，確定突變位點； (4) 通過生物信息學分析排除假基因位點干擾，確定真基因突變位點； (5) 將步驟（4)確定的真基因突變位點與已知的PKD1基因突變位點進行比較，確定 PKD1基因上的新突變位點。
9. 權利要求5-7任一項的方法，其中長片段擴增反應條件優(yōu)選是98°C Imin，然后進行 10個循環(huán)，每個循環(huán)為98°C 10s、68°C lOmin，然后進行20個循環(huán)，每個循環(huán)為98°C 10s、 68°C 10min20s，隨后72°C lOmin，然后置于4°C直至使用訊/或其中高通量測序優(yōu)選為Ion Torrent 測序。
10. 權利要求5-8任一項的方法，其中所述"生物信息學分析"包括W下步驟： a) 通過BLAST比對6個假基因序列與PKD1真基因序列，獲得6個假基因序列相對于 PKD1真基因序列的同源序列片段W及該些同源序列片段上假基因序列與PKD1真基因序列 的差異位點，構建假基因參考序列數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫中所包含的"假基因參考序列"為6個 假基因序列上的PKD1基因同源片段與PKD1真基因序列相應片段的差異位點； b) 將高通量測序結果與PKD1基因參考序列進行比對，獲得樣品相對于PKD1參考基因 的原始突變位點信息，其中包括突變位置、參考堿基、突變堿基、突變比例的信息； C)將原始突變位點信息與假基因參考序列數(shù)據(jù)庫進行比較，找出具有相應的假基因參 考序列的原始突變位點，構成用于回歸分析的原始突變位點集合，將該用于回歸分析的原 始突變位點集合中包含的突變位點按照擴增區(qū)域分組，其中每一組突變位點位于用一對引 物擴增的區(qū)域中且包含所述用于回歸分析的原始突變位點集合中位于該擴增的區(qū)域中的 所有突變位點；對于每一組突變位點，針對該組中所有突變位點的突變比例進行線性回歸 分析，確定平均值，該平均值為該組所對應的擴增區(qū)域內(nèi)的假基因擴增比例（即假基因污 染比例），另外從步驟b)獲得的原始突變位點找出位于該組所對應的擴增區(qū)域內(nèi)的所有原 始突變位點，從該些原始突變位點中找出突變比例相對于該組所對應的上述線性回歸分析 結果而言相當于高于該擴增區(qū)域內(nèi)的平均值的離群點的突變位點，該些相當于突變位點所 對應的突變被判定為PKD1真基因突變。
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于通過長片段PCR和高通量測序技術檢測PKD1基因突變的引物組、試劑盒和檢測反應體系；用于非診斷目的的體外檢測PKD1基因突變的方法、用于非診斷目的的體外PKD1基因分析方法和檢測PKD1基因上的新突變位點的方法，所述方法通過使用該引物組對樣品的PKD1基因進行長片段PCR擴增并進行高通量測序來進行檢測或分析。本發(fā)明的檢測結果不僅可以輔助診斷常染色體顯性遺傳性多囊腎病(即成人多囊腎病)，還可以獲得多個PKD1真基因上的之前未知的新突變，并將其提供給醫(yī)生或研究者以對這些突變與成人多囊腎病之間的關聯(lián)性進行研究。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68, G06F19-22
【公開號】CN104531883
【申請?zhí)枴緾N201510017500
【發(fā)明人】楊貴江, 張澤樘, 趙雪燕, 楊揚, 焦慧
【申請人】北京圣谷同創(chuàng)科技發(fā)展有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2015年1月14日