中的應(yīng)用：
[0121] W1、抑制關(guān)節(jié)表面纖維化的產(chǎn)品；
[0122] W2、抑制軟骨侵蝕的產(chǎn)品；
[0123] W3、預(yù)防和/或治療滑膜炎的產(chǎn)品；
[0124] W4、保護(hù)軟骨和/或滑膜的產(chǎn)品；
[0125] W5、預(yù)防和/或治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)品。
[0126] 本發(fā)明提供的siRNA可以作為關(guān)節(jié)炎及相關(guān)炎癥的治療藥物，可通過骨關(guān)節(jié)腔局 部注射siRNA或其制劑抑制炎癥因子表達(dá)實現(xiàn)對關(guān)節(jié)炎癥的治療。
【附圖說明】
[0127] 圖1為抑制ADAMTS-5基因的有效siRNA篩選。
[0128] 圖2為siRNA-RB-04免疫印跡實驗。
[0129] 圖3為siRNA-RB-04下調(diào)炎癥因子。
[0130] 圖4為siRNA結(jié)構(gòu)對靶基因沉默效果的影響。
[0131] 圖5為硫代磷酸（P-S鍵）的修飾位置示意圖。
[0132] 圖6為化學(xué)修飾增強(qiáng)寡聚核酸血清穩(wěn)定性。
[0133] 圖7為大鼠組織病理切片分析。
[0134] 圖8為大鼠關(guān)節(jié)液炎癥因子含量。
[0135] 圖9為抑制ADAM17基因的有效siRNA篩選。
[0136] 圖10為siRNA-AD-08免疫印跡實驗。
[0137] 圖11為siRNA-AD-08下調(diào)炎癥因子。
[0138] 圖12為siRNA結(jié)構(gòu)對靶基因沉默效果的影響。
[0139] 圖13為化學(xué)修飾增強(qiáng)寡聚核酸血清穩(wěn)定性。
[0140] 圖14為大鼠組織病理切片分析。
[0141] 圖15為大鼠關(guān)節(jié)液炎癥因子含量。
[0142] 圖16為siRNA聯(lián)合應(yīng)用下調(diào)炎癥因子。
[0143] 圖17為大鼠組織病理切片分析。
【具體實施方式】
[0144] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0145] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0146] hFLS細(xì)胞（人成纖維樣滑膜細(xì)胞）為Cell Applications產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為 408_05aD
[0147] 293T細(xì)胞為ATCC產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為CRL-3216。
[0148] MCF-7細(xì)胞為ATCC產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為HTB-22。
[0149] Human IL-I β immunoassay檢測試劑盒為AssayPro產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為 EI2200-1。
[0150] pGCsi-Hl/Neo在文獻(xiàn)"季國忠，張發(fā)明，黃曙等.Smad4/DPC4基因小發(fā)夾RNA質(zhì)粒 表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定[J].醫(yī)學(xué)研宄生學(xué)報，2006，19(11) :973-977"中公開過，公眾可從 廣州市銳博生物科技有限公司獲得。
[0151] Lipofectamine2000 試劑盒為 Invitrogen 產(chǎn)品。
[0152] 雄性SD大鼠（220±20g)為廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心產(chǎn)品。
[0153] 下述實施例中的siRNA均為雙鏈siRNA分子，注射大鼠的各注射液的溶劑均為 PBS0
[0154] 實施例1、抑制ADAMTS-5基因 mRNA表達(dá)的有效寡聚核酸的篩選
[0155] 一、進(jìn)行siRNA設(shè)計以確定靶向于ADAMTS-5的siRNA，并進(jìn)行生物信息篩選，確保 序列對于ADAMTS-5序列是特異性的且對于來自任何其他基因的序列不是特異性的。靶序 列使用NCBI提供的BLAST搜索引擎相對于GenBank中的序列進(jìn)行核對，經(jīng)過初步實驗篩 選出 8 個有效 siRNA，分別命名為 siRNA-RB-01、siRNA-RB-02、siRNA-RB-03、siRNA-RB-04、 siRNA-RB-05、siRNA-RB-06、siRNA-RB-07、siRNA-RB-08。以上 siRNA 為針對 ADAMTS-5 基 因序列不同位置設(shè)計的siRNA。
[0156] 二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0157] 實驗分為 10 組，分別為 siRNA-RB-01 至 siRNA-RB-08 實驗組，No target (NTC)陰 性對照組、NC空白對照組。
[0158] siRNA-RB-01至siRNA-RB-08實驗組的設(shè)置方法如下：
[0159] 將hFLS細(xì)胞用0. 25%的胰酶進(jìn)行消化，用DMEM培養(yǎng)基制成濃度為I X IO4個/ml 的細(xì)胞懸液，將其接種于12孔培養(yǎng)板中，每孔500ul，當(dāng)hFLS細(xì)胞生長至對數(shù)生長期（即 生長達(dá)80%融合成片）時，按照Lipofectamine2000試劑盒的說明書，將各個對應(yīng)的siRNA 按照50nM的終濃度轉(zhuǎn)染hFLS細(xì)胞。
[0160] No target (NTC)陰性對照組：將實驗組的siRNA替換為隨機(jī)非特異siRNA，其余步 驟不變。其中，隨機(jī)非特異siRNA不是特異針對于靶基因（ADAMTS-5基因）所設(shè)計的siRNA， 序列如下：
[0161] 正義鏈：5' -AGAUCGUUAGUUAGGUUGC dTdT-3' ；
[0162] 反義鏈：5 ' -GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3 '。
[0163] NC空白對照組：不加 siRNA，其余步驟與實驗組一致。
[0164] 三、在轉(zhuǎn)染24h后收集各組hFLS細(xì)胞，于IOOOrpm離心5分鐘，去除上清，Trizol 法提取各組的RNA。
[0165] 四、將各組的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以各組的cDNA為模板，以F和R為引物，進(jìn)行實 時熒光定量PCR，檢測結(jié)果如圖1所示，以β-actin為內(nèi)參基因。
[0166] 引物如下：
[0167] F: 5 ' -CTGCTCCCAGAAACAACG-3 ' ；
[0168] R: 5 ' -ATTCAGTGCCATCGGTCA-3 '。
[0169] 圖1表明，經(jīng)過前期篩選獲得的8個有效siRNA中，siRNA-RB-04對ADAMTS-5的 基因的沉默效果最好，抑制了 90%的基因表達(dá)量。
[0170] 其中siRNA-RB-04正義鏈的序列如SEQ ID No. 1所示，反義鏈的序列如SEQ ID No. 2所示。
[0171] siRNA-RB-04 正義鏈：5' -GGAUUUAUGUGGGCAUCAU-3'（SEQ ID No. 1)
[0172] siRNA-RB-04 反義鏈：5'-AUGAUGCCCACAUAAAUCC-3'（SEQ ID No. 2)
[0173] 五、Western blot 檢測
[0174] 取siRNA-RB-04實驗組的hFLS細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞2遍，倒 掉PBS，加入適量預(yù)冷的2XLysis Buffer，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，置于冰上充分裂解細(xì)胞 30min，于低溫離心機(jī)4°C，12000g，離心15min，取上清液，用Bradford法測定蛋白濃度，最 后將樣品蛋白的終濃度均調(diào)整為2 μ g/ μ 1，于_80°C冰箱保存?zhèn)溆?。分別取12 μ g總蛋白 量的樣品，加入等體積的2X loading buffer上樣緩沖液。將二者充分混勻后，在沸水中煮 浴10分鐘，4°C存放備用。根據(jù)目的蛋白分子量大小配制相應(yīng)濃度的膠（10%的SDS-PAGE 分離膠和5 %的濃縮膠），等膠制備好后，將梳子拔去后用電泳緩沖液清洗上樣孔，將之前 準(zhǔn)備好的樣品上樣，每孔加入蛋白樣品，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，在4°C， 400mA恒流條件下電轉(zhuǎn)2小時，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，隨后進(jìn)行顯色和曝光分析。
[0175] 同時以NC空白對照組和No target (NTC)陰性對照組進(jìn)行上述實驗作為對照。
[0176] 結(jié)果如圖2所示。
[0177] 圖2中，Control為NC空白對照組，no target為No target (NTC)陰性對照組， siRNA 為 siRNA-RB-04 實驗組。
[0178] 圖2表明，siRNA-RB-04顯著抑制了 ADAMTS-5的蛋白表達(dá)，后續(xù)選用siRNA-RB-04 做進(jìn)一步分析。
[0179] 實施例2、寡聚核酸對炎癥因子的抑制
[0180] 一、實驗分為如下各組：
[0181] 1^1^-8丨1?隱-1?-04實驗組：原代培養(yǎng)1^1^細(xì)胞至6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度約50%時， 按照Lipofectamine2000試劑盒說明書，將siRNA-RB-04按照50nM的終濃度轉(zhuǎn)染hFLS細(xì) 胞。
[0182] 2931'-8丨1?隱-1?-04實驗組：原代培養(yǎng)2931'細(xì)胞至6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度約50%時， 按照Lipofectamine2000試劑盒說明書，將siRNA-RB-04按照50nM的終濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0183] hFLS-No target (NTC)陰性對照組：將 hFLS-siRNA-RB-04 實驗組的 siRNA 替換為 隨機(jī)非特異siRNA，其余步驟與hFLS-siRNA-RB-04實驗組一致。其中，隨機(jī)非特異siRNA不 是特異針對于靶基因（ADAMTS-5基因）所設(shè)計的siRNA :
[0184] 正義鏈：5' -AGAUCGUUAGUUAGGUUGC dTdT-3' ；
[0185] 反義鏈：5 ' -GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3 '。
[0186] 293T-No target (NTC)陰性對照組：將 293T-siRNA-RB-04 實驗組的 siRNA 替換為 隨機(jī)非特異siRNA，其余步驟與293T-siRNA-RB-04實驗組一致。其中，隨機(jī)非特異siRNA不 是特異針對于靶基因（ADAMTS-5基因）所設(shè)計的siRNA :
[0187] 正義鏈：5' -AGAUCGUUAGUUAGGUUGC dTdT-3' ；
[0188] 反義鏈：5 ' -GCAACCUAACUAACGAUCUdTdT-3 '。
[0189] hFLS-NC空白對照組：hFLS-siRNA-RB-04實驗組中不加 siRNA，其余步驟與 hFLS-siRNA-RB-04 實驗組一致。
[0190] 293T-NC空白對照組：293T-siRNA-RB-04實驗組中不加 siRNA，其余步驟與 293T-siRNA-RB-04 實驗組一致。
[0191] 二、轉(zhuǎn)染24小時后，換無血清饑餓培養(yǎng)各組細(xì)胞24小時。
[0192] 三、在各組細(xì)胞中加入IL l-α，使其終濃度為l〇ng/ml，刺激24小時。
[0193] 四、提取各組細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以各組的cDNA為模板，分別以TNF-F和 TNF-R為引物，以cox2-F和cox2-R為引物，以IL-1I3-F和IL-Iii-R為引物，進(jìn)行實時熒光 定量PCR，對應(yīng)的檢測TNF、C0X-2和IL-Ιβ基因的表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參基因。
[0194] TNF-F: 5，-CGAGTGACAAGCCTGTAGCC-3，；
[0195] TNF-R: 5 ' -TGAAGAGGACCTGGGAGTAGAT-3 '。
[0196] cox2-F :5,-CAGGGTTGCTGGTGGTAGGA-3' ；
[0197] cox2