de alignment program. Bioinformatics2008, 24 (5):71 3-714 ；Li R, Yu C, Li Y, ea al, S0AP2: an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics2009, 25 (15) : 1966-1967,通過(guò)參照將其全文并入本文）比 對(duì)到 UCSC 人類參考基因組（hgl9, build37. 1，http: //genome, ucsc. edu/),以便獲得比 對(duì)到基因組上的唯一比對(duì)序列。然后利用SOAPsnp (可參見(jiàn)：Li R, Li Y, Fang X，Yang H, et al, SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res2009, 19(6) :1124-1132,通過(guò)參照將其全文并入本文）確定靶區(qū)域的基因型。
[0077] 結(jié)果，在病例IIl中發(fā)現(xiàn)66376個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs)和5418處的插入/缺 失，在病例113中發(fā)現(xiàn)了 62958單核苷酸多態(tài)性（SNPs)和4876處的插入/缺失。隨后通過(guò) dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://hgdownload. cse. ucsc. edu/goldenPath/hgl9/database/snpl35. txt. gz. )、HapMap 數(shù)據(jù)庫(kù)（ftp://ftp. ncbi. nlm. nih. gov/hapmap)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù) (ftp://ftp. IOOOgenomes. ebi. ac. uk/vo11/ftp)、炎黃數(shù)據(jù)庫(kù)（http://yh. genomics, org. cn/)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)的過(guò)濾，去掉上述獲得的測(cè)序結(jié)果中的同義突變、非編碼區(qū)的變異，以及 所有已知的且在數(shù)據(jù)庫(kù)中等位基因頻率大于0. 005的變異，并利用SIFT軟件進(jìn)行SNP功能 預(yù)測(cè)，最終得到50個(gè)可能具有致病意義的基因。
[0078] 同時(shí)發(fā)明人再通過(guò)連鎖分析的方法，成功定位了 17q21區(qū)段與該家系高度連鎖。 具體地，對(duì)家系內(nèi)6名患者和19名正常人，利用連鎖分析對(duì)致病基因進(jìn)行染色體初步定位， 在17號(hào)染色體單核苷酸多態(tài)（SNP) KRTAP9-4基因和LRRC46基因之間（17q21)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性 LOD值，區(qū)間最大LOD值Z=5. 3 ( Θ =〇. 〇〇)，提示該家系的致病基因與該區(qū)域連鎖。其中，連 鎖分析結(jié)果（即單體型分析結(jié)果）見(jiàn)圖4。
[0079] 而綜合外顯子測(cè)序及連鎖分析結(jié)果可知，該17q21區(qū)段內(nèi)外顯子測(cè)序結(jié)果的基因 為T(mén)UBG2、DCAKD、MYL4。再通過(guò)Sanger測(cè)序方法，對(duì)這三個(gè)基因上的侯選突變位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn) 證，結(jié)果僅有1個(gè)SNP為真正的共分離SNP位點(diǎn)，即MYL4基因的c. 31G>A雜合突變，該突變 導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生P. GlullLys錯(cuò)義突變。進(jìn)一步，通過(guò)家族中疾病共分離現(xiàn)象和對(duì)正常 人的SNP篩查，發(fā)明人認(rèn)為，MYL4基因?yàn)锳S的致病基因，而該雜合位點(diǎn)可能是致病位點(diǎn)。
[0080] 實(shí)施例2Sanger法測(cè)序驗(yàn)證
[0081] 分別對(duì)實(shí)施例1中所述的心房靜止患者家系中的所有家系成員（包括患者及家系 內(nèi)正常人）以及200名家系外正常人的MYL4基因進(jìn)行檢測(cè)：針對(duì)MYL4基因的c. 31G>A突 變?cè)O(shè)計(jì)引物，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化和測(cè)序的方法獲得突變位點(diǎn)有關(guān)序列，根據(jù)確定 序列測(cè)定結(jié)果屬于突變型還是野生型，驗(yàn)證MYL4基因及該突變與AS疾病之間的相關(guān)性。
[0082] 具體方法步驟如下：
[0083] UDNA 提取
[0084] 按照實(shí)施例1中所述的提取DNA的方法，分別提取制備受試者外周靜脈血中的基 因組DNA，備用。
[0085] 2、引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)
[0086] 首先，參考人類基因組序列數(shù)據(jù)庫(kù)hgl9/build36. 3,設(shè)計(jì)得到具有SEQ ID N0:3-4 所示核苷酸序列的MYL4基因外顯子特異性引物，具體序列如下：
[0087] 正向引物：5' -CTGTACCCTGCTGGCGTTTC-3'（SEQ ID NO :3);
[0088] 反向引物：5, -TGCCCTCACCTGCCGTAA-3'（SEQ ID NO :4)。
[0089] 接著，分別按照以下配比配制各基因組DNA樣本的PCR反應(yīng)體系以及進(jìn)行PCR反 應(yīng)：
[0090] 反應(yīng)體系：
[0091]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的編碼MYL4突變體的核酸，其特征在于，所述核酸與SEQ ID NO :1相比， 具有c. 31G>A突變， 任選地，所述核酸為DNA。
2. -種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID N0:2相比，所述分離的多肽具有 p. GlullLys 突變， 任選地，所述多肽是由權(quán)利要求1所述的核酸編碼的。
3. -種篩選易患心房靜止的生物樣品的方法，其特征在于，包括以下步驟： 從所述生物樣品提取核酸樣本； 確定所述核酸樣本的核酸序列； 所述核酸樣本的核酸序列與SEQ ID NO :1相比，具有c.31G>A突變是所述生物樣品易 患心房靜止的指示， 任選地，所述生物樣本為選自人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種， 任選地，所述核酸樣本為全基因組DNA。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，從所述生物樣品提取核酸樣本進(jìn)一步包 括： 從所述生物樣品提取RNA樣本，優(yōu)選所述RNA樣本為mRNA ;以及 基于所述RNA樣本，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣 本。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，確定所述核酸樣本的核酸序列進(jìn)一步包 括： 針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)；以及 對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果，任選地，采 用選自Hiseq2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝置的至少一種對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè) 序， 任選地,針對(duì)所述核酸樣本,構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)一步包括： 利用MYL4基因外顯子特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以及 針對(duì)所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，構(gòu)建所述核酸測(cè)序文庫(kù)， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列。
6. -種篩選易患心房靜止的生物樣品的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對(duì)所述核 酸樣本進(jìn)行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核 酸序列與SEQ ID NO :1相比，是否具有c. 31G>A突變，判斷所述生物樣品是否易患心房靜 止， 任選地，所述核酸提取裝置進(jìn)一步包括： RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及 反轉(zhuǎn)錄單元，所述反轉(zhuǎn)錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對(duì)所述RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構(gòu)成所述核酸樣本。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進(jìn)一步包括： 文庫(kù)構(gòu)建單元，所述文庫(kù)構(gòu)建單元用于針對(duì)所述核酸樣本，構(gòu)建核酸測(cè)序文庫(kù)；以及 測(cè)序單元，所述測(cè)序單元與所述文庫(kù)構(gòu)建單元相連，用于對(duì)所述核酸測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè) 序，以便獲得由多個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)成的測(cè)序結(jié)果， 任選地,所述文庫(kù)構(gòu)建單元進(jìn)一步包括： PCR擴(kuò)增模塊，所述PCR擴(kuò)增模塊中設(shè)置有MYL4基因外顯子特異性引物，以便利用所述 特異性引物，對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 任選地，所述特異性引物具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列， 任選地，所述測(cè)序單元包括選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測(cè)序裝置的至少一 種。
8. -種用于篩選易患心房靜止的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有： 適于檢測(cè)MYL4基因突變體的試劑，其中與SEQ ID NO :1相比，所述MYL4基因突變體具 有c. 31G>A突變， 任選地，所述試劑為核酸探針或引物， 任選地，所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列。
9. 一種構(gòu)建體，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的分離的編碼MYL4突變體的核酸。
10. -種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞是通過(guò)權(quán)利要求9所述的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化受 體細(xì)胞而獲得的。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了MYL4基因突變體及其應(yīng)用，具體涉及分離的編碼MYL4突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患心房靜止的生物樣品的方法，篩選易患心房靜止的生物樣品的系統(tǒng)，以及用于篩選易患心房靜止的生物樣品的試劑盒。其中，該分離的編碼MYL4突變體的核酸，與SEQ？ID？NO：1相比，具有c.31G>A突變。通過(guò)檢測(cè)該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測(cè)生物樣品是否易患心房靜止。
【IPC分類】C12M1-34, C12N5-10, C12N15-12, C12N15-63, C12N1-21, C12Q1-68, C07K14-47
【公開(kāi)號(hào)】CN104561015
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310514400
【發(fā)明人】張建國(guó), 肖晶晶, 彭文輝, 徐亞偉, 李海玲, 王俊, 汪建, 楊煥明
【申請(qǐng)人】深圳華大基因科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2013年10月25日