毒害艾美耳球蟲配子體抗原Engam59基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及毒害艾美耳球蟲的配子體抗原基因，由所述基因 編碼的多肽，含有所述基因的載體以及所述基因的獲取方法和多肽的體外表達方法以及功 能鑒定。具體地，本發(fā)明的基因來自于雞毒害艾美耳球蟲有性生殖階段的配子體。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞球蟲病是由艾美耳屬的一種或數(shù)種球蟲寄生在雞小腸或盲腸黏膜內(nèi)引起的嚴 重危害養(yǎng)雞業(yè)的原蟲病，估計每年全球因球蟲病的損失為30億美元。我國每年僅抗球蟲藥 的年消費就約6?18億元人民幣，由雞球蟲病造成的直接和間接經(jīng)濟損失則難以估計。長 期以來，雞球蟲病的防治主要依賴藥物。但由于球蟲對藥物普遍產(chǎn)生了耐藥性，引起藥效下 降。而且在雞飼養(yǎng)周期中長期添加藥物還導(dǎo)致藥物殘留肉蛋，直接危害人類健康，并污染環(huán) 境。為此，雞球蟲病的防治方法由化學(xué)預(yù)防轉(zhuǎn)向了免疫預(yù)防。
[0003] 目前，臨床上用于免疫預(yù)防雞球蟲病的疫苗有活蟲苗和由天然蛋白組成的亞單位 疫苗兩大類。雖然雞球蟲病活疫苗有著較強的免疫效果，但存在著如擴散病原的風險、球蟲 蟲株的抗原變異、致弱蟲株毒力易返強、疫苗接種劑量難以控制、疫苗影響飼料報酬、生產(chǎn) 成本高、免疫程序繁瑣、操作和免疫后的監(jiān)測和管理技術(shù)要求高等一些突出的問題。
[0004] 商品化的雞球蟲病亞單位疫苗是由來源于巨型艾美耳球蟲配子體的三種純化抗 原(分子質(zhì)量分別為230、82、56 kDa)配制而成，用于干擾卵囊壁的形成，即阻斷艾美耳球蟲 的有性生殖階段，從而降低卵囊的產(chǎn)生與傳播。由于該類疫苗的抗原需從配子體蛋白中經(jīng) 親和柱分離純化，配子體又需從感染雞體的腸道上皮細胞中分離純化，因此生產(chǎn)工藝復(fù)雜， 成本高，難易滿足生產(chǎn)需求。而利用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)該類抗原，可能是解決這一問題 的最佳策略。但巨型艾美耳球蟲配子體抗原Emga?似和Em 基因已受到專利保護，而 且在不同雞球蟲種類間缺乏完全的交叉保護力。
[0005] 毒害艾美耳球蟲是雞球蟲病的重要病原之一，主要發(fā)生在60日齡以上的雞。由于 在雞球蟲不同種間缺乏交叉保護性，毒害與柔嫩和巨型艾美耳球蟲在寄生部位的競爭性， 以及毒害艾美耳球蟲繁殖力低等原因，因此在育雛階段用疫苗免疫預(yù)防，往往不能控制雞 飼養(yǎng)后期由毒害艾美耳球蟲引發(fā)的球蟲病。從毒害艾美耳球蟲配子體克隆配子體抗原基 因，構(gòu)建原核表達載體表達重組抗原。用毒害艾美耳球重組配子體抗原或用毒害艾美耳球 蟲配子體抗原基因構(gòu)建的核酸疫苗免疫飼養(yǎng)后期的雞，針對性地防治毒害艾美耳球蟲引發(fā) 的球蟲病。
[0006] 迄今為止，文獻報道的毒害艾美耳球蟲配子體抗原基因僅見En基因，并已 受專利保護。除了 基因外，在國內(nèi)外還沒有其他毒害艾美耳球蟲配子體抗原基因 序列及其重組表達的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，克隆毒害艾美耳球蟲配子體抗原基因選取 編碼酪氨酸-絲氨酸和脯氨酸和甲硫氨酸特殊性結(jié)構(gòu)域并富含抗原表位的基因片段(第 631-1296位核苷酸)，轉(zhuǎn)入工程菌進行表達，獲得大量的重組抗原，并對重組抗原的特異性、 免疫原性等進行深入研究，旨為研制雞球蟲重組配子體抗原疫苗奠定基礎(chǔ)。
[0008] 本發(fā)明涉及毒害艾美耳球蟲的一種配子體抗原基因，其中，所述的基因全長為 1473 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。： 其中包含的開放閱讀框大小為1473 bp，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。 選取第211-432位氨基酸片段進行原核表達。
[0009] 本發(fā)明涉及到一種表達載體pET28a(+)，其含有所述配子體抗原基因。將分離得 到的配子體抗原基因插入酶切位點，連接到原核表達載體pET28a(+)中，常規(guī)轉(zhuǎn)化腸桿菌 BL21 (DE3 )，構(gòu)建基因工程菌，并誘導(dǎo)表達，對表達產(chǎn)物進行分離、純化和復(fù)性。
[0010] 此外，本發(fā)明涉及一種真核表達載體pcDNA3. 1 (+)，其含有所述配子體抗原基 因。將分離得到的En濟皿5?因片段插入酶切位點，連接到pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建成 pcDNA3. 1(+)- En濟皿^真核重組質(zhì)粒，免疫小鼠獲得多克隆抗體；以此鼠多抗為一抗，以原 核表達的重組蛋白為抗原進行Western-blot檢測，鑒定真核質(zhì)粒的免疫原性。 [0011] 作為優(yōu)選的方案，具體操作是： 1)從毒害艾美耳球蟲配子體基因中分離因： 常規(guī)方法分離純化毒害艾美耳球蟲配子體，用RNA提取試劑盒提取總RNA。設(shè)計特異性 引物： 上游引物：5' - ATGACTCGTCTCGCCGCCTGCGCTG -3'（ SEQ ID NO. 3); 下游引物：5' - TTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCC -3'（ SEQ ID N0.4);。
[0012] 以配子體總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的CDNA為模板，經(jīng)過PCR條件的反復(fù)優(yōu)化后，成功 擴增出與預(yù)期結(jié)果相符且大小為1473 bp左右的特異性片段（圖1)，命名為En濟皿5^。 將含有目的片段PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化回收后，克隆到pGEM-T-easy載體中，得到 pGEM-T-easy-En^'續(xù)級
[0013] 2)原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)毒害艾美耳球蟲En濟皿5?因的ORF序列和質(zhì)粒pET28a(+)酶切位點，選取編碼 第211-432位氨基酸的基因片段，設(shè)計1對特異性引物： 上游引物F:5'_ CCGGAATTCGCTGAGGAGGATATTGTGAAG -3'，（ SEQ ID NO. 5);含feoR I 酶切位點(劃線部分）和3個保護性堿基； 下游引物R:5'_ CCGAAGCTTTTATGCTGGGTAGGCGGGGTA -3'，（ SEQ ID NO. 6);含歷·α!ΙΙΙ 酶切位點(劃線部分)、終止密碼子(黑體部分）和3個保護性堿基。
[0014] 以構(gòu)建的pGEM-T-eaSy-En^^ffl?體為模板，成功擴增出與預(yù)期結(jié)果相符且大小 為687bp左右的特異性片段（圖2)，并將此片段連接到原核表達載體pET28a(+)中，得到 pET28a (+) -Engam59〇
[0015] 3)毒害艾美耳球蟲En濟皿5?因的高效表達，純化，復(fù)性 將構(gòu)建好的原核表達載體pET28a (+) -En濟皿5^化BL21宿主菌，IPTG誘導(dǎo)表達后，經(jīng) 過可溶性分析，發(fā)現(xiàn)此體外重組表達的蛋白以包涵體形式存在（圖3)。重組蛋白的大量表 達時，超生裂解釋放包涵體后，尿素變性。變性蛋白通過含有HIS標簽的Ni-NTA親和層析 純化后，分別在含有6M、4M、2M、IM尿素的透析液和不含尿素的PBS中各復(fù)性8h，最終通過 PEG8000濃縮，收集蛋白，12% SDS-PAGE分析（圖4)，4° C保存。
[0016] 4)體外重組表達蛋白的特異性和免疫原性檢測 分別以抗HIS的單克隆抗體（圖5)、鼠抗En濟皿5·游]多克隆抗體（圖6)和毒害艾美耳球 蟲卵囊三次免疫后雞的康復(fù)血清（圖7)為一抗，采用Western-blot方法檢測重組蛋白的特 異性和免疫原性。
[0017] 本發(fā)明還公開了所述因在構(gòu)建防治雞毒害艾美耳球蟲核酸疫苗中的 應(yīng)用。
[0018] 所述核酸疫苗的構(gòu)建如下： 根據(jù)En濟皿5?因序列和PCDNA3. 1 (+)的特性，設(shè)計1對特異性引物： 上游引物 Fl :5'_ CCGAAGCTTGCTGAGGAGGATATTGTGAAG -3'（ SEQ ID NO. 7)，，含 III酶切位點(劃線部分）和3個保護性堿基； 下游引物 Rl :5'_ CCGGAATTCTTATGCTGGGTAGGCGGGGTA -3'（ SEQ ID NO. 8)，，含 feoR I酶切位點(劃線部分)、終止密碼子(黑體部分）和3個保護性堿基。
[0019] 以構(gòu)建的為模板，成功擴增得到與預(yù)期結(jié)果相符大 小為687bp左右的特異性片段（圖8)，并將該目的片段連接到質(zhì)粒pcDNA3. 1(+)中，得到 pcDNA3. I (+) -Engam59〇
[0020] 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3. 進行feoR I和班《1 III雙酶切鑒定（圖9)， 選擇陽性克隆株測序，確定閱讀框正確后大量克隆用于后續(xù)試驗。
[0021] 核酸疫苗的免疫原性分析： 鼠抗重組質(zhì)粒PCDNA3. I (+) -En濟皿5^克隆抗體的制備：取6~8周齡BALB/c雌 鼠6只，肌肉注射0. 75%利多卡因50 μ 1/只輔助擴散，24h后在相同部位注射重組質(zhì)粒 pcDNA3. I (+)你100 μ g/只。此后第2周第3周各加強免疫一次，操作與劑量不變。 3次免疫后第10天摘眼球取血，37° C靜置30min，4° C靜置4h，2500rpm離心15min，收集 分離血清。以此血清為一抗，采用Western-blot方法檢測原核表達的重組蛋白， 從而鑒定核酸疫苗的免疫原性（圖10)。
【附圖說明】
[0022] 圖1是毒害艾美耳球蟲En濟皿5?因整個ORF擴增結(jié)果。泳道1為標準分子量； 泳道2為擴增得到的目的片段，大小為1473bp。
[0023] 圖2是毒害艾美耳球蟲因第211-432位氨基酸編碼區(qū)基因，加入酶切 位點、保護性堿基和終止密碼子后的擴增結(jié)果。泳道1為標準分子量；泳道2為擴增得到的 目的片段，大小為687bp。
[0024] 圖3是毒害艾美耳球蟲En濟皿5?因體外重組表達蛋白可溶性分析結(jié)果，其中1 : 標準蛋白質(zhì)分子量標記；2 :菌體裂解后的上清；3 :菌體裂解后的包涵體。
[0025] 圖4是毒害艾美耳球蟲En濟皿5?因的純化和復(fù)性結(jié)果分