析，其中1 :標(biāo)準(zhǔn)蛋白 質(zhì)分子量標(biāo)記；2 :重組菌超生后上清；3 :包涵體尿素裂解后沉淀；4 :包涵體尿素裂解后上 清；5 :結(jié)合緩沖液作用下裂解液與Ni-NTA結(jié)合后的流出液；6 :洗滌緩沖液的第一次洗脫 液；7 :洗滌緩沖液的第三次洗脫液；8 =Ni-NTA親和純化后的目的蛋白。
[0026] 圖5是Western-blot鑒定體外重組表達(dá)蛋白特異性的結(jié)果，其中1 :預(yù)染蛋白質(zhì) 分子量標(biāo)記；2 :pET28a(+)/BL21 IPTG 誘導(dǎo)；3 :BL21 IPTG 誘導(dǎo)；4 :pET28a(+)-En濟(jì)孤5?/ BL21 IPTG 誘導(dǎo)。
[0027] 圖6是鼠抗毒害艾美耳球蟲體外重組表達(dá)蛋白Engam59多克隆抗體Western-blot 檢測結(jié)果，其中1 :預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；2 :pET28a(+)-En濟(jì)皿5^/BL21 IPTG誘導(dǎo)；3 : pET-28a(+)/BL21 IPTG 誘導(dǎo)；4:BL21 IPTG 誘導(dǎo)。
[0028] 圖7是毒害艾美耳球蟲三次免疫雞的康復(fù)血清Western-blot檢測結(jié)果，其中 1 :預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；2 :pET28a(+)-En^a?5^/BL21 IPTG 誘導(dǎo)；3 :pET-28a(+)/BL21 IPTG 誘導(dǎo)；4 :BL21 IPTG 誘導(dǎo)。
[0029] 圖8是構(gòu)建核酸疫苗用En濟(jì)皿5·堪因片段擴(kuò)增結(jié)果：其中1 :標(biāo)準(zhǔn)分子量；2、3是 擴(kuò)增得到的目的片段，大小為687bp。
[0030] 圖9是重組質(zhì)粒pcDNA3. l-Εη^?皿53雙酶切鑒定結(jié)果：其中1 :標(biāo)準(zhǔn)分子量；2、3、4 是雙酶切結(jié)果，其中質(zhì)粒片段大小為5391 bp，目的片段大小為687 bp。
[0031] 圖10是毒害艾美耳球蟲因體外重組表達(dá)蛋白對重組真核質(zhì)粒免疫小 鼠多克隆抗體Western-blot檢測結(jié)果，其中1 :預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；2 :BL21 IPTG誘 導(dǎo)；3:pET-28a(+)/BL21IPTG誘導(dǎo)；4 :pET-28a(+)-En濟(jì)孤5?/BL21IPTG誘導(dǎo)。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0033] 實(shí)施例1:從毒害艾美耳球蟲配子體基因中分離En濟(jì)皿5?因 常規(guī)方法分離純化毒害艾美耳球蟲配子體，用RNA提取試劑盒提取總RNA。
[0034] RT-PCR釣取En濟(jì)孤5·堪因： 參照TaKaRa公司的（TaKaRa RNA LA PCRtmKU (AMV) Ver. 1.1)提供的方法：兩步法 RT-PCR試劑盒擴(kuò)增濟(jì)皿5?因。
[0035] En濟(jì)孤5·堪因的釣取采用上游引物（5, - ATGACTCGTCTCGCCGCCTGCGCTG -3'）和 下游引物（5, - TTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCC -3'）。
[0036] 第一步：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總體系為 10μ 1 :0· 5μ 1 總 RNA? 500ng total RNA)，2y 1 25mM 的 MgCl2，lyl 10XRNA PCR Buffer，4.25yl RNase Free dH20，lyl 濃度為 10 mM 的 dNTP，0.25yl RNase Inhibitor，0.5yl 5ιι/μ1 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和0·5μ1 Oligo dT接頭引 物。反應(yīng)步驟：42° C逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30min;99° C變性5min;5° C冷卻5min。
[0037] 第二步：PCR 反應(yīng)，總體積為 50μ 1 : 3μ I 25mM 的 MgCl2,4y I 10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)，31. 75μ 1 滅菌蒸餾水，0· 25μ I TaKaRa LA Taq，0. 5μ 1 上游引物 (10μΜ)，0. 5μ 1下游引物（ΙΟμΜ)，然后把第一步反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的產(chǎn)物10μ 1加入到此 體系中。PCR反應(yīng)步驟：94° C預(yù)變性3min;94° C變性30s;60° C退火30s;72° C延 伸1.5min，共28個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1。將得到 的因克隆到pGEM-T-Easy載體中，送往華大基因公司測序。（重組載體命名為： pGEM-T-Easy-Enga?^) 〇
[0038] 實(shí)施例2:表達(dá)片段En濟(jì)皿5?勺擴(kuò)增 根據(jù)毒害艾美耳球蟲因的ORF序列和質(zhì)粒pET28a(+) (Invitrogen，USA) 的酶切位點(diǎn)，選取第211-432位氨基酸編碼區(qū)基因片段，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增表達(dá)用的基 因片段。
[0039] 根據(jù)質(zhì)粒pET28a(+)上具備的酶切位點(diǎn)，對En濟(jì)皿5?因進(jìn)行序列分析后，選擇第 211-432位氨基酸編碼區(qū)基因進(jìn)行截短表達(dá)，選取feoR I和沒ial III兩個(gè)酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)得 到的特異性引物為：上游引物（5' - CCGGAATTCGCTGAGGAGGATATTGTGAAG -3'）含 feoR I 酶 切位點(diǎn)（劃線部分）和3個(gè)保護(hù)性堿基，下游引物（5' - CCGAAGCTTTTATGCTGGGTAGGCGGGGTA -3'）含III酶切位點(diǎn)(劃線部分)、含終止密碼子(黑體部分）和3個(gè)保護(hù)性堿基。
[0040] 50μ I PCR反應(yīng)體系如下：5μ I IOX反應(yīng)緩沖液；濃度為ΙΟμΜ的上、下游 引物各 1μ1，4μ1 dNTP (IOmM) ;37· 5μ I H2O ;0· 5μ I TaKaRa LA Taq 酶，1 μ 1 模板 pGEM-T-Easy-En濟(jì)孤59。95。C 變性 5min ;95。C 變性 30s，60。C 退火 30s，72。C 延伸 lmin，共30個(gè)循環(huán)；72° C，延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖 2。擴(kuò)大反應(yīng)體系后，將得到的PCR產(chǎn)物純化回收，-20° C保存?zhèn)溆谩?br>[0041] 實(shí)施例3:原核表達(dá)載體的構(gòu)建 雙酶切 pET28a(+): I 和 III為 Fermentas 產(chǎn)品。50 μ 1 酶切體系為：5 μ I IOXFastDigest Green Buf?e;r，20μl載體pET28a(+)，F(xiàn)astDigesti?oRI和FastDigest//i/7dΠI各2·5μl，20μl ddH20。37 ° C反應(yīng)2h，1. 2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收產(chǎn)物。
[0042] 雙酶切實(shí)施例2中純化的PCR產(chǎn)物： I 和//ifldIII為 Fermentas 產(chǎn)品。100 μ 1 酶切體系：10 μ I IOXFastDigest Green Buffer ;20 μ 1 純化 PCR 產(chǎn)物；FastDigest I 和 FastDigest III各 5 μ 1 ;60 μ I ddH20。37° C反應(yīng)2h，I. 2%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收酶切產(chǎn)物。
[0043] 連接反應(yīng)： Solution I 為 TaKaRa 產(chǎn)品。8μ 1 雙酶切載體 pET28a(+)，2y 1 雙酶切 PCR 產(chǎn)物，10μ 1 solution I，16° C 連接過夜。
[0044] 取10 μ 1連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 α。涂布到含有卡那霉素抗性的LB平板， 第二天挑取單克隆，過夜培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，采用雙酶切鑒定法挑選陽性克隆(重組載體命 名為：pET28a(+)-En濟(jì)皿5^)，并送交華大基因公司測序。
[0045] 實(shí)施例4:En 貧基因在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 挑取測序正確的克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)BL21(DE3)。挑取單個(gè)菌落接種到3ml LB培養(yǎng)液（含 lOOyg/ml卡那霉素）中，37° C，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，按1 : 100轉(zhuǎn)接種到IOml含相同 濃度抗生素 LB中，37° C 200rpm振蕩培養(yǎng)4h，加入終濃度為ImM的IPTG，37° C 200rpm 誘導(dǎo)4h，12% SDS-PAGE檢測表達(dá)情況。結(jié)果如圖3,清楚表明表達(dá)的蛋白分子量在28 kDa 左右，而且主要存在于包涵體內(nèi)。
[0046] 實(shí)施例5:表達(dá)產(chǎn)物的純化和復(fù)性 4° C 12 OOOrpm離心5min收集菌體，以0. IM PBS重懸沉淀，然后冰浴超聲(超聲2s， 間隙3s，25min)。4° C 12000rpm離心IOmin,收集包涵體沉淀。沉淀中加入10ml Lysis Equilibrium Buffer (100 mM NaH2PO4,10 mM Tris_Cl，8M urea，pH 8.0)，超聲（超聲 2s， 間隙3s，15min)輔助包涵體的裂解，4° C 12000rpm離心10min，收集上清加入到預(yù)先用LE Buffer平衡處理的Ni-NTA柱中，4° C作用30min，期間要不斷的搖晃。按照GenScript公 司提供的操作手冊純化蛋白。
[0047] 收集 Elution Buffer (100 mM NaH2PO4,10 mM Tris-Cl，500 mM Imidazole，8 M urea，pH 8.0)洗脫的蛋白，裝入透析袋，在復(fù)性緩沖液（50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/ L NaCl，pH 8. 0)分別加入611、4]?、21、1]\1尿素進(jìn)行梯度透析復(fù)性，每個(gè)濃度的尿素，4°〇 透析復(fù)性8h，最后在含有OM尿素的PBS (pH8. 0)中透析復(fù)性8h。PEG8000濃縮蛋白，12% SDS-PAGE檢測，蛋白-20° C保存。重組蛋白的純化和復(fù)性結(jié)果如圖4。
[0048] 實(shí)施例6:表達(dá)產(chǎn)物的特異性檢測 將誘導(dǎo)的陽性重組菌、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和未轉(zhuǎn)化菌蛋白20 μ