一種海洋適冷酯酶及其編碼基因e40與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種海洋適冷酯酶及其編碼基因 E40與應(yīng)用,屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 醋類(lèi)水解酶(lipolytic enzymes)包括醋酶(esterases)和脂肪酶(lipases),其 代表了一大類(lèi)能催化酯鍵的水解與合成的水解酶。酯酶(esterase)通常作用于簡(jiǎn)單的酯 類(lèi)或低于10個(gè)碳原子的短鏈甘油酯,而脂肪酶(lipase)通常作用于難溶于水的長(zhǎng)鏈甘油 酯(多10個(gè)碳原子)。酯類(lèi)水解酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。微生物資源豐富,并 且利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶具有便于工業(yè)化生產(chǎn)、易純化等優(yōu)點(diǎn),因此微生物來(lái)源的酯類(lèi)水解 酶已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品釀造、醫(yī)藥化學(xué)、污水處理和生物修復(fù)等領(lǐng)域。微生物酯類(lèi)水 解酶的應(yīng)用主要包括以下幾個(gè)方面:
[0003] (1)食品加工方面:釀酒和食用醋的生產(chǎn)、食用油脂的精煉、面包專(zhuān)用粉和食品乳 化劑的生產(chǎn)、天然抗氧化劑的生產(chǎn)、以及飲料添加劑等食品工業(yè)。
[0004] (2)精細(xì)化工方面:合成藥品、農(nóng)用化學(xué)品、風(fēng)味化合物以及化妝品的主要中間產(chǎn) 物等。
[0005] (3)環(huán)境治理方面:對(duì)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑等農(nóng)藥具有高效降解能力,減少農(nóng)藥污染,增 強(qiáng)食品安全。
[0006] 根據(jù)生化性質(zhì)和氨基酸序列,微生物來(lái)源的酯類(lèi)水解酶主要分為8個(gè)家族, 第I-VIII家族。其中,第I家族以脂肪酶為主,第IV家族以酯酶為主,其它家族包 含酯酶和脂肪酶。第IV家族細(xì)菌酯類(lèi)水解酶與哺乳動(dòng)物來(lái)源的激素敏感性脂肪酶 (hormone-sensitive lipase,HSL)在序列上表現(xiàn)出很高的相似性,因此該家族也被稱(chēng)為細(xì) 菌HSL家族。細(xì)菌HSL家族酯酶因其在嗜熱微生物、超嗜熱微生物以及熱液口等極端環(huán)境 中多次被發(fā)現(xiàn),而受到越來(lái)越多的關(guān)注。這些來(lái)自高溫環(huán)境中的HSL酯酶表現(xiàn)出對(duì)環(huán)境的 適應(yīng)性,為熱穩(wěn)定性極強(qiáng)的嗜熱酶。到目前為止,該家族已經(jīng)有多個(gè)酶蛋白被研宄,并且該 家族已有超過(guò)20個(gè)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)被解析。已報(bào)道的細(xì)菌HSL酯酶主要為熱穩(wěn)定的中溫 酶和嗜熱酶,而對(duì)低溫酯酶和適冷酯酶鮮有報(bào)道。
[0007] 在酯酶中,適冷酯酶由于在低溫下具有很高的活性,因此在食品風(fēng)味劑的生產(chǎn)、飲 食業(yè)含酯廢物和廢水的處理等行業(yè)中比中高溫酯酶更具優(yōu)越性,已經(jīng)受到研宄者的廣泛關(guān) 注。隨著分子生物學(xué)和宏基因組學(xué)的發(fā)展,越來(lái)越多的研宄人員從不同環(huán)境樣品中篩選產(chǎn) 酯類(lèi)水解酶微生物,克隆酯類(lèi)水解酶基因,構(gòu)建高產(chǎn)的基因工程菌,為后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)打 下基礎(chǔ)。環(huán)境樣品主要來(lái)自土壤以及海洋,特別是海洋環(huán)境樣品。海洋中大部分區(qū)域處于 低溫、高壓以及寡營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境中,微生物在這樣的環(huán)境中會(huì)形成與環(huán)境相適應(yīng)的獨(dú)特的生 理結(jié)構(gòu)和代謝方式。因此,海洋微生物為適冷酯酶的發(fā)現(xiàn)提供了巨大的資源。并且,宏基因 組技術(shù)能從不同海洋環(huán)境中獲取多種酯酶而不依賴(lài)于海洋微生物菌株的培養(yǎng),這大大豐富 了微生物酯酶的種類(lèi),也為獲取新型適冷酯酶提供了廣闊的來(lái)源。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種海洋適冷酯酶及其編碼基因 E40與應(yīng)用。
[0009] 一種海洋適冷酯酶基因 E40,核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 上述基因編碼的海洋適冷酯酶E40,氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0011] -種重組表達(dá)載體,該表達(dá)載體包含有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的功能片 段。
[0012] 一種重組細(xì)胞,該宿主菌包含有上述重組表達(dá)載體或表達(dá)上述海洋適冷酯酶E40。
[0013] 上述海洋適冷酯酶E40和/或上述海洋適冷酯酶基因 E40在食品風(fēng)味劑的生產(chǎn)、 飲食業(yè)含酯廢物和廢水處理中水解短碳鏈酯類(lèi)及其衍生物的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明海洋適冷酯酶的基因 E40來(lái)自南海海底沉積物樣品E505宏基因組文庫(kù)中 大腸桿菌EPI300克隆子E40-6B的大片段質(zhì)粒fosmid DNA。通過(guò)構(gòu)建E40-6B克隆子中 fosmid的亞克隆文庫(kù)和后期測(cè)序,確定了該克隆子fosmid上攜帶的酯酶基因 E40的核酸序 列。根據(jù)E40基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,利用PCR技術(shù)從E40-6B克隆子的fosmid DNA克 隆了編碼海洋適冷酯酶E40的基因,構(gòu)建了含海洋適冷酯酶基因 E40的表達(dá)載體以及含有 該表達(dá)載體的大腸桿菌重組細(xì)胞。測(cè)序結(jié)果表明酯酶基因 E40為一個(gè)含有894個(gè)核苷酸的 開(kāi)放閱讀框架,該開(kāi)放閱讀框架共編碼297個(gè)氨基酸。因此酯酶E40是一個(gè)含有297個(gè)氨 基酸的多肽。序列分析表明,酯酶E40屬于細(xì)菌HSL家族。對(duì)純化的酯酶E40進(jìn)行性質(zhì)測(cè) 定。結(jié)果表明該酶對(duì)短碳鏈酯類(lèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解活性。最適pH為8.0,且在pH 5. 0-9.0 范圍內(nèi)穩(wěn)定存在。最適酶活溫度為45°C,且在超過(guò)30°C的環(huán)境下很不穩(wěn)定。其穩(wěn)定存在于 0-20°C中,在0°C仍保留約10 %的活力,在20°C保留40 %的活力,這表明酯酶E40是一個(gè)新 型的HSL家族的適冷酯酶。
[0015] 有益效果
[0016] 1、本發(fā)明所述的酯酶E40在0_20°C具有較高的催化效率,應(yīng)用于在低溫或常溫下 能水解乳脂產(chǎn)生短鏈的脂肪酸,這些物質(zhì)會(huì)增強(qiáng)奶制品的風(fēng)味,并避免長(zhǎng)時(shí)間的高溫而影 響食品的質(zhì)量進(jìn)而影響口味和營(yíng)養(yǎng)成分組成;同時(shí),用適冷酯酶E40處理飲食業(yè)產(chǎn)生的含 酯廢棄物和廢水時(shí),安全、高效,對(duì)環(huán)境保護(hù)有非常積極的意義。
[0017] 2、本發(fā)明所述的酯酶E40在低溫下有較高酶活性,中高溫下極不穩(wěn)定,中溫下很 快就可以完全失活,從而保證了其使用的安全性。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1、提取的大腸桿菌EPI300克隆子E40-6B的fosmid DNA的電泳圖;
[0019] 其中:1、大腸桿菌EPI300克隆子E40-6B的fosmid DNA,M、DNA分子量標(biāo)記 (marker);
[0020] 圖2、通過(guò)PCR擴(kuò)增克隆的編碼適冷酯酶E40的基因片段的電泳圖;
[0021] 其中和2、擴(kuò)增的DNA片段,M、DNA分子量標(biāo)記(marker);
[0022] 圖3、在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)和純化的適冷酯酶E40電泳圖;
[0023] 其中:1、含空質(zhì)粒pET28a的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌體超聲波破碎后的 上清液電泳圖,為陰性對(duì)照,2、含重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌體超聲 波破碎后的上清液電泳圖,3和4、上清液經(jīng)過(guò)鎳柱親和層析純化后的純酯酶E40電泳圖,M、 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記(marker);
[0024] 圖4、適冷酯酶E40的底物特異性分析;
[0025] 圖5、適冷酯酶E40的酶活溫度曲線;
[0026] 其中:實(shí)線代表溫度對(duì)酶活性的影響,虛線代表溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響;
[0027] 圖6、適冷酯酶E40的酶活pH曲線;
[0028] 其中:實(shí)線代表pH對(duì)酶活性的影響,虛線代表pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明,但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。 [0030] 實(shí)施例1
[0031] 一種海洋適冷酯酶基因 E40,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。上述基因編碼一 種海洋適冷酯酶E40,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0032] 基因 E40共894bp,其中含有一個(gè)894bp的開(kāi)放閱讀框架,其編碼適冷酯酶E40,起 始密碼子位于Ibp,終止密碼子位于892bp,共編碼297個(gè)氨基酸。
[0033] 實(shí)施例2 :適冷酯酶E40編碼基因序列的測(cè)定
[0034] 菌種來(lái)源:南海海底沉積物樣品E505宏基因組文庫(kù)中大腸桿菌EPI300克隆子 E40-6B。
[0035] 具體步驟如下:
[0036] I. 1大腸桿菌EPI300克隆子E40-6B中大片段質(zhì)粒fosmid的提取,參照OMEGA公 司BAC/PAC DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)
[0037] (1)取I. 5_5ml克隆子E40-6B菌液,13, OOOrpm離心3min,棄上清,收集菌體,盡 可能的吸凈上清;
[0038] (2)向步驟(1)制得的菌體中加入200 μ 1添加了 RNase A的緩沖液Tl重懸細(xì)胞, 震蕩混勾,得重懸液;
[0039] (3)向步驟⑵制得的重懸液中加入200 μ 1緩沖液T2,通過(guò)輕柔地顛倒5-10次 進(jìn)行混勻,以獲得清亮的裂解液,室溫放置5min ;
[0040] (4)向步驟(3)制得的裂解液中加入200 μ 1預(yù)冷的緩沖液T3,通過(guò)輕柔地顛倒 15-20次進(jìn)行混勻直到形成白色的絮狀沉淀,冰浴5min ;
[0041] (5)將步驟(4)制得的混合液,于4°C條件下,13, OOOrpm離心IOmin ;
[0042] (6)將離心后的上清液轉(zhuǎn)移至新的I. 5ml離心管中,加入200 μ 1經(jīng)異丙醇稀釋的 BAC結(jié)合緩沖液,立刻劇烈顛倒3-5次充分混勻;
[0043] (7)將步驟(6)中制得的混合液加入到洗脫柱HiBincT DNA MicroElute column 中;
[0044] (8) 13, OOOrpm 離心 30sec,棄廢液;
[0045] (9)向洗脫柱中加入750 μ 1漂洗液SPW,13, OOOrpm離心30sec,棄廢液;
[0046] (10)將吸附柱放回空的收集管中,13, OOOrpm離心2min,盡量除去漂洗液,以免漂 洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng);
[0047] (11)取出吸附柱放入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中,在吸附膜的中間部位加 20-50 μ 1洗脫緩沖液EB或無(wú)菌水,室溫放置5min,13, OOOrpm離心2min ;
[0048] (12)DNA置于-20°C冰箱保存,提取到的大片段fosmid DNA如圖1所示。
[0049] 1.2亞克隆文庫(kù)的構(gòu)建
[0050] 用限制性?xún)?nèi)切酶Sau3AI (購(gòu)自Fermentas公司)對(duì)提取到的fosmid進(jìn)行部分消 化,以獲取I. 5-5kbp的DNA片段,將其連接到經(jīng)BamHI消化及去磷酸化處理的pUC19質(zhì)粒 (購(gòu)自NEB公司)上。連接反應(yīng)液電轉(zhuǎn)E. coli ToplO感受態(tài)細(xì)胞,涂布含有100 μ g/ml氨 芐青霉素和1% (v/v)三丁酸甘油酯(購(gòu)自Sigma公司)的LB固體平板,37°C倒置培養(yǎng) 12-16h,構(gòu)建成酯類(lèi)水解酶活性克隆子E40-6B的fosmid DNA的亞克隆文庫(kù)。
[0051] 1. 3酯類(lèi)水解酶基因序列的確定
[0052] 選取固體平板上產(chǎn)生透明降解圈的亞克隆,提取質(zhì)粒并以載體特異性引物M13F/R 進(jìn)行測(cè)序。用 GeneMark 軟件(http://opal, biology, gatech. edu/GeneMark/)預(yù)測(cè) DNA 序 列上可能的開(kāi)放閱讀框架。用BLASTX在NCBI nr庫(kù)中對(duì)預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框架進(jìn)行相似性 搜索,以確定克隆子E40-6B上攜帶的酯