酶基因序列E40。因此，獲得酯酶E40編碼基因 E40 的序列為894bp，序列如SEQ ID NO. 1所示。該基因編碼一個297氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID NO. 2 所示。
[0053] 實施例3 :酯酶E40的克隆、異源表達(dá)及分離純化
[0054] 2. 1利用PCR對E40基因序列進(jìn)行擴增
[0055] (1)根據(jù)E40基因序列設(shè)計兩條特異性引物：
[0056] 40F ：CGGCATATGGCCAAAAGCCCAGAGTT (SEQ ID NO. 3)，用下劃線標(biāo)出的是 NdeI 酶切 位點；
[0057] 40R ：GCCAAGCTTTCAGCCGATCTGCTTCCGC(SEQ ID NO. 4)，用下劃線標(biāo)出的是HindIII 酶切位點；
[0058] 引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。
[0059] (2)以40F和40R為引物，以E40所在的fosmid為模板，用FastPfu DNA聚合酶 (購自Transgen公司）擴增目的基因片段。
[0060] PCR反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性2min ;然后95°C變性20sec ;55°C退火20sec ;72°C延 伸20sec，30個循環(huán)后；72°C延伸10min。
[0061] (3)對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行Iwt %瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明獲得一條約1，OOObp的 DNA片段（如圖2)。然后用Omega公司的DNA回收試劑盒按照其說明回收擴增DNA片段。
[0062] (4)用限制性內(nèi)切酶NdeI和HindIII對回收片段和質(zhì)粒pET28a進(jìn)行雙酶切。酶 切反應(yīng)體系如下：
[0063] 酶切緩沖液 2μ1 酶切緩沖液 2μ1 內(nèi)切酶NdeI 1 μ? 內(nèi)切酶NdeI 1 μ? 內(nèi)切酶 HindIII 1 μ? 內(nèi)切酶 HindIII 1 μ? 回收DNA片段 10 μ? 質(zhì)粒pET28a 6 μ? 補力口 ddH20 至 20 μ? 補力口 ddH20 至 20 μ?
[0064] 放在37°C水浴中反應(yīng)2個小時。對酶切產(chǎn)物進(jìn)行l(wèi)wt%瓊脂糖凝膠電泳，然后用 Omega公司的DNA回收試劑盒按照其說明回收擴增DNA片段。
[0065] (5)將經(jīng)過雙酶切的E40基因片段連接到pET28a載體上。連接反應(yīng)體系：
[0066] 載體 pET28a 1 μ I
[0067] 外源DNA片段 4 μ 1
[0068] Solution I 5 μ I
[0069] 蓋緊蓋子，手指輕彈離心管，混勻樣品，在離心機上轉(zhuǎn)2sec，把樣品集中在管底， 16 °C水浴中連接過夜。
[0070] (6)按《分子克隆實驗指南》上制備大腸桿菌感受態(tài)的方法制備大腸桿菌DH5 α感 受態(tài)。
[0071] (7)按《分子克隆實驗指南》上的熱激轉(zhuǎn)化方法將連接好的重組pET28a載體轉(zhuǎn)至 大腸桿菌DH5a感受態(tài)。
[0072] (8)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5 a涂布于含50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37°C過夜培 養(yǎng)。挑選陽性克隆子，轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行NdeI/HindIII雙酶切， 通過酶切驗證正確的質(zhì)粒送北京華大基因公司測序。
[0073] 2·2重組表達(dá)載體pET28a-E40轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中
[0074] (1)按《分子克隆實驗指南》上制備大腸桿菌感受態(tài)的方法制備大腸桿菌BL21感 受態(tài)；
[0075] (2)按《分子克隆實驗指南》上的熱激轉(zhuǎn)化方法將連接好的重組pET28a載體轉(zhuǎn)至 大腸桿菌BL21感受態(tài)；
[0076] (3)將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21涂于含50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C過夜 培養(yǎng)。
[0077] 2. 3基因 E40在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)與純化
[0078] (1)在平板上挑取單菌落，接于20ml含50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 37 °C過夜培養(yǎng)；
[0079] (2) 1% (v/v)接種量轉(zhuǎn)接到含50 μ g/ml卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng) 至菌濃度OD為0. 8,加入IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)在20 °C搖床培養(yǎng)20h ;
[0080] (3)收集經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的1，000ml LB培養(yǎng)液，12, OOOrpm離心lOmin，收集菌 體；
[0081] (4)用 IOOml 含 IOOmM NaCl 的 50mM Tris-HCl 緩沖液（pH 8. 0)懸浮菌體；
[0082] (5)將重新懸浮的菌液進(jìn)行超聲波破碎（600W，IOmin);
[0083] (6)將破碎后的菌液12, OOOrpm離心20min，收集上清液；
[0084] (7)將上清液按照說明書的要求進(jìn)行鎳柱親和層析；
[0085] (8)層析后收集的樣品用SDS-PAGE檢測純度，證明已經(jīng)獲得酯酶E40的電泳純酶 (如圖3)。用50mM的Tris-HCl (pH 8. 0)緩沖液透析3-4次。最后置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0086] 實施例4 :酯酶E40的性質(zhì)測定
[0087] 3. 1底物特異性分析
[0088] 用異丙醇配制不同碳鏈長度的pNP醋底物，C2-C16 (購自Sigma公司）。標(biāo)準(zhǔn)反 應(yīng)為：20 μ I IOmM pNPC4 底物與 960 μ I 50mM Tris-HCl (pH 8. 0)混合液于 45°C預(yù)熱 3min 后，加入20 μ 1稀釋好的酶液并于45°C反應(yīng)5min，立即加100 μ I 20wt% SDS終止反應(yīng)，測 定004(15值。以不加酶液的反應(yīng)作為空白對照。標(biāo)準(zhǔn)曲線以不同濃度的pNP(購自Sigma公 司）來繪制。酶活力定義為，在一定溫度下，每分鐘催化PNP酯底物水解產(chǎn)生ΙμΜ pNP所 需的酶量為一個酶活力單位（U)。結(jié)果表明，E40對C4-C10底物表現(xiàn)出較高的活力，對C4 底物的降解能力最強，比活力為372U/mg(如圖4)。
[0089] 3. 2最適溫度及溫度穩(wěn)定性分析
[0090] 最適反應(yīng)溫度的測定：以PNPC4為底物，在50mM TriS-HCl (pH 8. 0)緩沖體系中， 分別檢測 E40 在 0°C、10°C、20°C、30°C、40°C、45°C、50°C、60°C和 70°C 下的酶活。最高酶活 定義為100%。結(jié)果表明該酶的最適酶活溫度為45°C，其在0_20°C低溫仍保留10% -40% 的高活力（如圖5)。
[0091] 溫度穩(wěn)定性分析：酶液分別在0°0、10°0、20°0、30°0、40°0和50°0下溫育111，然后 取相同的酶量檢測E40在45°C、50mM Tris-HCKpH 8.0)緩沖體系中的殘余活力。0°C酶活 定義為100%。結(jié)果表明該酶在0-20°C條件下穩(wěn)定存在，在超過30°C的條件下變得很不穩(wěn) 定（如圖5)。
[0092] 3. 3最適pH及pH穩(wěn)定性分析
[0093] pNPC4底物在堿性條件下不穩(wěn)定，酶反應(yīng)完成后向反應(yīng)體系中加入等體積的含 2wt% SDS的2M Tris-HCl (pH 7. 0)終止液以去除pH對反應(yīng)的影響。
[0094] 最適反應(yīng)pH的測定：配制pH值在4. 0-11. 0范圍內(nèi)、間隔1個pH單位的 Britton-Robinson緩沖液。測定E40在45°C、不同pH條件下的酶活，最高酶活定義為 100%。結(jié)果表明該酶的最適pH為8.0(如圖6)。
[0095] pH穩(wěn)定性分析：取1 μ 1純酶，加入199 μ 1不同pH的緩沖液，以配制不同pH的 E40,4°C溫育Ih后檢測E40的殘余活力。最高酶活定義為100%。結(jié)果表明該酶在5. 0-9. 0 的pH范圍內(nèi)表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性（如圖6)。
[0096] 4.結(jié)果
[0097] 利用試劑盒提取了大腸桿菌EPI300克隆子E40-6B的fosmid DNA(圖1)。通過 構(gòu)建該fosmid DNA的亞克隆文庫和后期測序，確定了大腸桿菌克隆子E40-6B中fosmid上 所攜帶的酯酶基因 E40的核酸序列。根據(jù)E40基因序列設(shè)計特異性引物，利用PCR技術(shù)從 E40-6B克隆子的fosmid DNA克隆了編碼海洋適冷酯酶E40的基因片段（圖2)，構(gòu)建了含 海洋適冷酯酶基因 E40的表達(dá)載體以及含有該表達(dá)載體的大腸桿菌重組細(xì)胞。
[0098] 基因 E40含有一個894bp的開放閱讀框架，其編碼適冷酯酶E40,起始密碼子位于 lbp，終止密碼子位于892bp，共編碼297個氨基酸。序列分析表明，酯酶E40屬于細(xì)菌HSL 家族。將基因 E40在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)和純化，獲得成熟有活性的酯酶E40 (圖3)。 對純化的酯酶E40進(jìn)行性質(zhì)測定。結(jié)果表明該酶對碳鏈長度在4-10個碳原子的短碳鏈酯類 表現(xiàn)出較強的降解活性（圖4)。最適酶活溫度為45°C，且在超過30°C的環(huán)境下很不穩(wěn)定， 在30°C溫育Ih后即喪失約80%的活力（圖5)。其在0-20°C條件下穩(wěn)定存在，在0°C仍保 留約10%的活力，在20°C保留40%的活力（圖5)。最適pH為8.0,且在pH 5. 0-9.0范圍 內(nèi)穩(wěn)定存在（圖6)。上述結(jié)果表明，基因 E40編碼的酯酶E40是一個新型的HSL家族的堿 性適冷酯酶。
【主權(quán)項】
1. 一種海洋適冷酯酶基因 E40,核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述海洋適冷酯酶基因 E40編碼的海洋適冷酯酶E40,氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3. -種重組表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含有如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列的功能片段。
4. 一種重組細(xì)胞，該宿主菌包含有權(quán)利要求3所述重組表達(dá)載體或表達(dá)權(quán)利要求2所 述海洋適冷酯酶E40。
5. 權(quán)利要求2所述海洋適冷酯酶E40和/或權(quán)利要求1所述海洋適冷酯酶基因 E40在 食品風(fēng)味劑的生產(chǎn)、飲食業(yè)含酯廢物和廢水處理中水解短碳鏈酯類及其衍生物的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種海洋適冷酯酶及其編碼基因E40與應(yīng)用。一種海洋適冷酯酶基因E40，核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示；本發(fā)明所述的酯酶E40在0-20℃具有較高的催化效率，應(yīng)用于在低溫或常溫下能水解乳脂產(chǎn)生短鏈的脂肪酸，這些物質(zhì)會增強奶制品的風(fēng)味，并避免長時間的高溫而影響食品的質(zhì)量進(jìn)而影響口味和營養(yǎng)成分組成；同時，用適冷酯酶E40處理飲食業(yè)產(chǎn)生的含酯廢棄物和廢水時，安全、高效，對環(huán)境保護(hù)有非常積極的意義。
【IPC分類】C12N15-55, A23L1-30, C12N15-70, C12N9-18, B09B3-00, C12N1-21, C02F3-34
【公開號】CN104561059
【申請?zhí)枴緾N201510025698
【發(fā)明人】張玉忠, 李平一, 陳秀蘭, 解彬彬, 張熙穎, 宋曉妍, 蘇海楠, 秦啟龍, 石梅, 周百成
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月19日