結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群快速鑒定方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬檢測試劑領(lǐng)域，涉及核分枝桿菌復(fù)合群檢測鑒定試劑盒及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定的方法，尤其涉及通過檢測分枝桿菌16S rRNA編碼基因特異的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，鑒定分枝桿菌屬細(xì)菌，并鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌的試劑盒及鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了結(jié)核病是長期威脅人類健康的傳染性疾病，其病原體是結(jié)核分枝桿菌，全球約三分之一人口感染結(jié)核分枝分枝桿菌。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2011年全球共有結(jié)核病新發(fā)病例870萬，約140萬人死于結(jié)核病。中國屬于全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病人數(shù)居全球第二位。我國每年約有新發(fā)病例100萬，約13萬人死于結(jié)核病。因此，結(jié)核病至今仍是威脅人類健康的全球性衛(wèi)生問題。
[0003]結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTBC)包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌，研究顯示，引起人類結(jié)核病的主要病原菌是結(jié)核分枝桿菌；非結(jié)核分枝桿菌(NTM)廣泛分布于環(huán)境中(如濕土、沼澤、河流)，屬于機(jī)會致病菌。在臨床診斷中，在感染NTM引起的NTM肺病中，由于其癥狀、體征與MTBC感染引起的肺結(jié)核病類似，因而常難以區(qū)別。但醫(yī)療實踐中，由于對兩種疾病采取的治療藥物不同，因此在臨床診斷中需要快速、準(zhǔn)確地鑒別MTBC與NTM，從而選擇正確的藥物進(jìn)行治療。
[0004]通常，傳統(tǒng)的鑒別MTBC和NTM的方法是通過培養(yǎng)、染色、進(jìn)行菌型生化鑒定，其存在費(fèi)時耗力的缺陷。目前，我國普遍采用對硝基苯甲酸(PNB )和噻吩-2-羧酸肼(TCH)的羅氏培養(yǎng)基生長試驗鑒定MTBC和NTM，該方法耗時長達(dá)I個月，因此無法滿足臨床快速診斷的需求。臨床實踐中，需要建立快速、準(zhǔn)確、特異、敏感的MTBC/NTM菌種鑒定的方法以采用正確的藥物對病患進(jìn)行有效治療、控制結(jié)核病蔓延，這是目前臨床實驗室中快速鑒定分枝桿菌感染所面臨的巨大挑戰(zhàn)。
[0005]16S rRNA編碼基因rrs是細(xì)菌系統(tǒng)分類研究中最有效和最常用的分子鐘，由于其種類少，含量大(約占細(xì)菌RNA含量的80% )，其進(jìn)化具有良好的時鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，素有“細(xì)菌化石”之稱。rrs基因約1.5Kb左右，由于能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，因此常被用于菌種鑒定。而基于實時熒光定量PCR的探針熔解曲線分析技術(shù)，以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測的重要工具。本申請的發(fā)明人擬提供一種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群快速檢測鑒定方法及其試劑盒，通過實時熒光定量PCR探針熔解曲線法檢測rrs基因上分枝桿菌屬和MTBC特異的SNP位點(diǎn)，達(dá)到鑒定分枝桿菌屬細(xì)菌，并進(jìn)一步鑒別MTBC和NTM的目的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的之一在于針對臨床結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定中的技術(shù)缺陷，提供一種速度快、靈敏度高、特異性好的檢測方法，用于鑒定分枝桿菌屬，并鑒別MTBC與NTM。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供一種鑒定分枝桿菌屬并鑒別MTBC與NTM的檢測試劑盒。
[0008]為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:基于實時熒光定量PCR平臺，結(jié)合非對稱擴(kuò)增PCR技術(shù)和探針熔解曲線分析技術(shù)，并在同一反應(yīng)體系中檢測不同熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物所形成的熔解曲線峰，通過熔解曲線峰值(Tm)的判讀來達(dá)到以上檢測目的。
[0009]本發(fā)明的具體工作原理是通過特異性引物非對稱擴(kuò)增目標(biāo)16S rRNA基因單鏈片段，基于實時熒光定量PCR技術(shù)平臺，通過熒光雙標(biāo)記探針熔解曲線分析鑒定待測樣本的基因型，判定是否屬于分枝桿菌屬并進(jìn)一步鑒別MTBC與NTM。本發(fā)明所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)脫氧核苷酸單鏈。當(dāng)探針在游離狀態(tài)下時，熒光基團(tuán)的信號被淬滅基團(tuán)所吸收，此時檢測不到熒光；當(dāng)探針與模板互補(bǔ)結(jié)合后，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，熒光激發(fā)。而在熔解曲線分析時，隨著溫度的升高，探針與模板的結(jié)合與解鏈則反應(yīng)在突光信號的改變上，而通過比較完全匹配與不完全匹配的模板DNA在突光信號改變所對應(yīng)的溫度差異，可判斷該樣本在所檢測區(qū)域的基因型，從而判斷該樣本所屬的菌種類型。
[0010]本發(fā)明提供了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群快速鑒定試劑盒，用于鑒定分枝桿菌菌屬并鑒別MTBC與NTM，所述的試劑盒中，包括一對引物和兩條探針；所述引物包括16SrRNA基因特異性的上游引物16sR和下游引物16sL ;用于鑒定分枝桿菌屬的探針Probe-Myco (FAM突光標(biāo)記)；用于鑒別MTBC與NTM的探針Probe-Mtbc (R0X熒光標(biāo)記)。
[0011]本發(fā)明提供了一種分枝桿菌屬及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定方法，通過序列比對，設(shè)計了用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的熒光探針及擴(kuò)增引物，并基于實時熒光定量PCR平臺，通過非對稱擴(kuò)增PCR技術(shù)和探針熔解曲線分析技術(shù)，檢測rrs基因上分枝桿菌屬和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異的SNP位點(diǎn)，從而達(dá)到鑒定分枝桿菌屬細(xì)菌，并進(jìn)一步鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌的目的。
[0012]具體的，本發(fā)明的一種分枝桿菌屬及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定方法，其特征在，其包括步驟:
[0013]步驟1，以分枝桿菌屬16SrRNA編碼基因特定序列為待測靶標(biāo)，設(shè)計一對通用引物，對待測樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0014]步驟2，以分枝桿菌屬16SrRNA編碼基因特定序列為檢測靶標(biāo)，設(shè)計兩條熒光雙標(biāo)記探針分別用于鑒定分枝桿菌屬(FAM熒光)和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(R0X熒光)；
[0015]步驟3，通過對探針熔解曲線及Tm值分析，從而鑒定待測樣本是否屬于分枝桿菌屬或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。
[0016]本發(fā)明中，通過對分枝桿菌屬細(xì)菌16SrRNA編碼基因比對分析，選定其中一條長度為451bp的片段作為目標(biāo)序列，其序列編號為SEQ ID N0.1 ；
[0017]本發(fā)明中，根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計一對通用引物，對分枝桿菌屬細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增；弓丨物序列為:
[0018]上游引物16sR:5’ -TACCTGGGTTTGACATGCAC-3，(SEQ ID N0.2)
[0019]下游引物16sL:5’ -CGGGTGTTACCGACTTTCAT-3’ (SEQ ID N0.3)；
[0020]本發(fā)明中，根據(jù)目標(biāo)序列中的兩個檢測區(qū)域設(shè)計兩條熒光雙標(biāo)記探針，探針5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)(FAM或ROX)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)(BHQ1或BHQ2)；
[0021]探針序列為:
[0022]熒光探針Probe-Myco:5’-FAM-TGCACgACCTGCACACAGGCgACAAG-BHQl-3’ (SEQ IDN0.4)；
[0023]熒光探針Probe-Mtbc:5，-R0X-TGAGACCGGCTTTTAAGGATTCG-BHQ2-3，(SEQ IDN0.5)。
[0024]更具體的，本發(fā)明的實施例中，通過下述步驟進(jìn)行分枝桿菌屬及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定:
[0025]1.通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中的分枝桿菌屬與非分枝桿菌、MTBC與NTM的16SrRNA基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)比對分析，選擇具有識別并區(qū)分分枝桿菌與非分枝桿菌以及MTBC與NTM的保守序列片段作為靶標(biāo)，其基因片段的擴(kuò)增目標(biāo)序列為:
[0026]tacctgggtttgacatgcacaggacgcgtctagagataggcgttcccttgtggcctgtgtgcaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtctcatgttgccagcacgtaatggtggggactcgtgagagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggccggtacaaagggctgcgatgccgcgaggttaagcgaatccttaaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccg 革巴標(biāo)序列(SEQ ID N0.1)
[0027]2.應(yīng)用Primer3軟件設(shè)計對以上目標(biāo)序列擴(kuò)增的上游引物16sR和下游弓丨物16sL。應(yīng)用Primer express軟件設(shè)計突光雙標(biāo)記探針Probe-Myco (突光基團(tuán)為FAM,淬滅基團(tuán)為BHQ1)和Probe-Mtbc (熒光基團(tuán)為R0X，淬滅基團(tuán)為BHQ2):探針Probe-Myco用于鑒定分枝桿菌屬，該探針為突變型探針，即覆蓋區(qū)域與分枝桿菌屬細(xì)菌該序列區(qū)域有兩個錯配位點(diǎn)，而與非分枝桿菌屬細(xì)菌則由于錯配更多無法結(jié)合，因此該探針的設(shè)計目的在于通過是否熔解曲線峰來判定是否屬于分枝桿菌屬；探針和Probe-Mtbc用于鑒別MTBC與NTM，該探針與MTBC細(xì)菌該序列區(qū)域完全互補(bǔ)匹配，而與NTM細(xì)菌該序列區(qū)域則存在不同位點(diǎn)或數(shù)量的錯配，從而使MTBC的熔解曲線峰值較NTM高，因此可通過熔解曲線峰值(Tm)判定MTBC 或 NTM ；