[0069]1.內(nèi)參質(zhì)粒與陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建
[0070]內(nèi)參質(zhì)粒構(gòu)建:人工合成一條DNA單鏈片段，該片段包含上下游引物(16sR、16sL)的結(jié)合序列以及與探針Probe-Myco完全互補(bǔ)匹配的序列，以該序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到雙鏈產(chǎn)物，并將該產(chǎn)物克隆到PMD19-T載體中，并進(jìn)行DNA序列測定。將該重組質(zhì)粒作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品，并命名為16s-1C。內(nèi)參質(zhì)粒以低(50拷貝/反應(yīng))濃度加入到每個反應(yīng)體系中，目的是監(jiān)測整個反應(yīng)體系是否正常工作:1)當(dāng)檢測樣本為非分枝桿菌DNA時，此時內(nèi)參能夠正常擴(kuò)增并被檢測，熔解曲線峰Tm值為76°C (±0.5°C);2)當(dāng)檢測樣本為分枝桿菌DNA時，由于所加臨床樣本DNA濃度在16-1O7拷貝/反應(yīng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于內(nèi)參質(zhì)粒濃度，此時優(yōu)先擴(kuò)增分枝桿菌DNA并被檢測，熔解曲線峰Tm值為67V ( ±0.5°C );3)當(dāng)檢測樣本中存在抑制PCR反應(yīng)成分時，整個體系將擴(kuò)增失敗，既沒有內(nèi)參熔解曲線峰，也沒有分枝桿菌熔解曲線峰；
[0071]陽性對照質(zhì)粒構(gòu)建:用設(shè)計的上下游引物16sR與16sL對實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增得到目標(biāo)基因片段，將該片段克隆到PMD19-T載體中，并進(jìn)行DNA序列測定，將該重組質(zhì)粒作為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)品，并命名為16S-PC。每次檢測需做陽性對照檢測試驗(yàn)，做兩次重復(fù)，陽性對照熔解曲線作為判斷MTBC的參照曲線；
[0072]2.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0073]將質(zhì)粒16s-1C與16s-PC經(jīng)過提取純化后，用NanoDrop?ND-2000分光光度計檢測質(zhì)粒濃度與純度，并根據(jù)摩爾質(zhì)量與阿伏伽德羅常數(shù)換算成拷貝數(shù)。計算公式如下:
[0074]質(zhì)粒拷貝數(shù)=(C*N)/ (1*109*M)
[0075]C代表質(zhì)粒的濃度(ng/ul)；
[0076]M代表質(zhì)粒的摩爾質(zhì)量(g/mol);
[0077]N代表阿伏伽德羅常數(shù)(6.02X 1023/mol)。
[0078]實(shí)施例3:臨床分枝桿菌基因組DNA提取
[0079]用熱裂解法提取分枝桿菌基因組DNA:1)從固體培養(yǎng)基上刮取1-2接種環(huán)分枝桿菌，重懸于10uL TE中，80°C滅活30分鐘，2)滅活后的菌株拿出P3實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行如下操作:100°C煮沸I分鐘，立即置冰上2分鐘，12000r/min離心10分鐘后，取上清置于另一無菌EP管中，-20 V保存，該上清液即用于PCR擴(kuò)增的模板DNA。
[0080]實(shí)施例4:反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化
[0081]I)引物濃度與比例的優(yōu)化:在反應(yīng)體系的其他條件不變的情況下，調(diào)整上下游引物16sR與16sL的濃度比例，分別在5:1，8:1，10:1，15:1，20:1，25:1，30:1幾種不同的濃度比例下驗(yàn)證擴(kuò)增效率，經(jīng)過重復(fù)實(shí)驗(yàn)確定20:1的最優(yōu)引物擴(kuò)增比例；
[0082]2) mTaq酶量的優(yōu)化:比較在mTaq酶量在0.5U，1U，1.5U，2U的不同濃度下反應(yīng)擴(kuò)增效率，選定IU為最優(yōu)酶量濃度；
[0083]3)內(nèi)參質(zhì)粒濃度的優(yōu)化:比較在內(nèi)參質(zhì)粒濃度為10拷貝/反應(yīng)，50拷貝/反應(yīng)，100拷貝/反應(yīng)，1000拷貝/反應(yīng)的不同情況下陰性對照以及待測樣本中內(nèi)參質(zhì)粒的檢測信號，選定50拷貝/反應(yīng)為最佳內(nèi)參質(zhì)粒濃度；
[0084]4)PCR反應(yīng)參數(shù)的優(yōu)化:根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度為451bp，因此PCR反應(yīng)的延伸時間在20s?25s之間，比較在15s，20s, 25s不同的擴(kuò)增時間下反應(yīng)的擴(kuò)增效率，選定72°C延伸時間為20s。
[0085]實(shí)施例5:試劑盒的靈敏度測試
[0086]采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv基因組DNA，并用NanoDropTMND-2000分光光度計檢測DNA樣本的濃度與純度，并根據(jù)基因組DNA摩爾質(zhì)量與阿伏伽德羅常數(shù)換算成拷貝數(shù)。計算公式如下:
[0087]DNA 拷貝數(shù)=(ON) / (1*109*M)
[0088]C 代表 DNA 的濃度(ng/ul)；
[0089]M代表基因組DNA的摩爾質(zhì)量(g/mol)；
[0090]N代表阿伏伽德羅常數(shù)(6.02 X 12Vmol)
[0091 ] 將基因組DNA濃度分別標(biāo)準(zhǔn)稀釋到5 X 15拷貝/反應(yīng)，5 X 14拷貝/反應(yīng)，5 X 13拷貝/反應(yīng)，5 X 12拷貝/反應(yīng)，5 X 11拷貝/反應(yīng)，5 X 10°拷貝/反應(yīng)，將不同梯度濃度的DNA樣本分別用于上述反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，每個濃度梯度做兩個平行反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示^父^^拷貝/反應(yīng)^父^^拷貝/反應(yīng)^父^^拷貝/反應(yīng)^父^^拷貝/反應(yīng)^父川1拷貝/反應(yīng)均有較明顯的熔解曲線峰，而5X10°拷貝/反應(yīng)的樣本信號較低。因此，本方法靈敏度可準(zhǔn)確檢測50拷貝/反應(yīng)濃度以上的臨床分枝桿菌DNA樣本。
[0092]實(shí)施例6:試劑盒的特異性檢驗(yàn)
[0093]為了驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的特異性，分別采用非分枝桿菌(大腸桿菌)、結(jié)核分枝桿菌(結(jié)核分枝桿菌實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv以及臨床結(jié)核分枝桿菌樣本)、非結(jié)核分枝桿菌(鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、海分枝桿菌、恥垢分枝桿菌等)的DNA提取物按上述反應(yīng)條件進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，Probe-Myco探針只有分枝桿菌屬細(xì)菌呈陽性檢測結(jié)果，Probe-Mtbc探針只有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群DNA樣本與陽性對照一致；本發(fā)明試劑盒可嚴(yán)格特異地鑒定分枝桿菌屬，并鑒別MTBC與NTM。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種分枝桿菌屬及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定方法，其特征在于，其包括步驟: 步驟1，以分枝桿菌屬16SrRNA編碼基因特定序列為待測靶標(biāo)，設(shè)計一對通用引物，對待測樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟2，以分枝桿菌屬16SrRNA編碼基因特定序列為檢測靶標(biāo)，設(shè)計兩條熒光雙標(biāo)記探針分別用于鑒定分枝桿菌屬(FAM突光)和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(ROX突光)； 步驟3，通過對探針熔解曲線及Tm值分析，鑒定待測樣本是否屬于分枝桿菌屬或結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過對分枝桿菌屬細(xì)菌16SrRNA編碼基因比對分析，選定長度為451bp的片段作為目標(biāo)序列，其序列編號為SEQ ID N0.1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計一對通用引物，對分枝桿菌屬細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增；引物序列為:上游引物 16sR:5’-TACCTGGGTTTGACATGCAC-3’ (SEQ ID N0.2)下游引物 16sL:5，-CGGGTGTTACCGACTTTCAT-3，(SEQ ID N0.3)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，根據(jù)目標(biāo)序列中的兩個檢測區(qū)域設(shè)計兩條熒光雙標(biāo)記探針，探針5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)(FAM或R0X)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)(BHQ1或BHQ2), 探針序列為: 熒光探針 Probe-Myco:5’ -FAM-TGCACgACCTGCACACAGGCgACAAG-BHQl-3，(SEQ IDN0.4)；熒光探針 Probe-Mtbc:5’ -R0X-TGAGACCGGCTTTTAAGGATTCG-BHQ2-3’ (SEQ ID N0.5)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法中的PCR擴(kuò)增與檢測反應(yīng)體系中，包括:1mM 濃度 Tris, 50mM 濃度 KCl，2.5mM 濃度 MgCl2,0.2mM 濃度 dNTPs，luM 濃度 16sR 引物，0.05uM濃度16sL引物，2U mTaq DNA聚合酶，10?10ng模板DNA，加ddH20至總體積為 20ul。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法中的PCR擴(kuò)增及溶解曲線反應(yīng)條件為: 第一步:95°C，3min ;第二步:如下過程進(jìn)行40循環(huán):95°C，15s ;55°C，1s (檢測熒光)；72°C, 20s ;第三步:從45°C上升至85°C，每0.5°C檢測一次熒光；檢測通道選用FAM和R0X。
7.一種結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群快速鑒定試劑盒，其特征在于，包括一對引物和兩條探針；所述引物包括16S rRNA基因特異性的上游引物16sR和下游引物16sL ;用于鑒定分枝桿菌屬的探針Probe-Myco (FAM熒光標(biāo)記);用于鑒別MTBC與NTM的探針Probe-Mtbc (R0X熒光標(biāo)記)。
【專利摘要】本發(fā)明屬檢測試劑領(lǐng)域，涉及核分枝桿菌復(fù)合群檢測鑒定試劑盒及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定的方法，本方法通過序列比對，設(shè)計了用于檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的熒光探針及擴(kuò)增引物，并基于實(shí)時熒光定量PCR平臺，通過非對稱擴(kuò)增PCR技術(shù)和探針熔解曲線分析技術(shù)，檢測rrs基因上分枝桿菌屬和結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群特異的SNP位點(diǎn)，從而達(dá)到鑒定分枝桿菌屬細(xì)菌，并進(jìn)一步鑒別結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌的目的。本發(fā)明方法具有操作簡便，檢測時間短，特異性強(qiáng)靈敏度高的特點(diǎn)。
【IPC分類】C12Q1-04, G01N21-64, C12Q1-68
【公開號】CN104561245
【申請?zhí)枴緾N201310485727
【發(fā)明人】羅濤, 柳清云, 高謙
【申請人】復(fù)旦大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年10月16日