產(chǎn)生重組艾杜糖-2-硫酸酯酶的方法
【專利說(shuō)明】產(chǎn)生重組艾杜糖-2-硫酸酯酶的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年6月29日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/666, 712的優(yōu) 先權(quán)；其完整內(nèi)容在此通過(guò)引用并入。
[0003] 序列表
[0004] 在本說(shuō)明書(shū)提及在2013年6月27日以電子形式提交的命名為"2006685-0339_ SEQ_LIST"的ASCII.txt文件的序列表。所述.txt文件于2013年6月25日產(chǎn)生，并且大 小為21KB。將序列表的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
[0005] 背景
[0006] 粘多糖貯積癥II型（MPS II，亨特綜合癥）是因酶艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)的 缺乏而引起的X染色體連鎖隱性溶酶體貯積癥。I2S從葡糖氨基聚糖（GAG)硫酸皮膚素和 硫酸乙酰肝素切割末端2-0-硫酸酯部分。由于亨特綜合癥患者中喪失I2S酶或存在有缺 陷的I2S酶，因此GAG在多種細(xì)胞類型的溶酶體中逐漸累積，從而導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，器官腫大， 組織破壞和器官系統(tǒng)功能障礙。
[0007] -般而言，具有亨特綜合癥的人的身體表現(xiàn)包括軀體和神經(jīng)癥狀。例如，在亨特綜 合癥的一些病例中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累導(dǎo)致發(fā)育遲緩和神經(jīng)系統(tǒng)的問(wèn)題。而亨特綜合癥的 非神經(jīng)癥狀在出生時(shí)一般不存在，隨著時(shí)間的推移，GAG在體內(nèi)細(xì)胞中的漸進(jìn)累積可能對(duì)身 體的外周組織具有巨大影響。GAG在外周組織中的累積導(dǎo)致患者面部特征的鮮明粗糙度，并 且造成前額突出、扁平橋和巨舌，此為亨特綜合征患者的最典型特征。類似地，GAG的累積 可不利地影響身體的器官系統(tǒng)。最初表現(xiàn)為心臟、肺和呼吸道的壁的增厚，以及肝、脾和腎 的異常腫大，這些深刻的變化最終可導(dǎo)致廣泛的災(zāi)難性器官衰竭。因此，亨特綜合癥總是嚴(yán) 重的、進(jìn)行性的和限制壽命的。
[0008] 酶替代療法（ERT)是用于治療亨特綜合癥（MPS II)的批準(zhǔn)的療法，其包括向亨特 綜合癥患者施用外源替代I2S酶。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明除其它事項(xiàng)以外提供了用于大規(guī)模產(chǎn)生重組I2S酶以促進(jìn)亨特綜合癥的 有效治療的方法。在本發(fā)明之前，使用含血清培養(yǎng)基的滾瓶貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)已被成功地開(kāi)發(fā) 來(lái)大規(guī)模產(chǎn)生重組I2S。然而，本申請(qǐng)的發(fā)明人開(kāi)發(fā)了這樣的系統(tǒng)，該系統(tǒng)能使用無(wú)動(dòng)物組 分、化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基在大規(guī)模器皿中有效地懸浮培養(yǎng)共表達(dá)I2S和甲酰甘氨酸生成 酶（FGE)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以高效地產(chǎn)生大量重組I2S酶。出乎意料的是，使用無(wú)動(dòng)物組 分懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組I2S酶還已顯著地改善了酶活性，因?yàn)橐赃@種方式產(chǎn)生的重組 I2S具有異常高水平的Ca-甲酰甘氨酸（FGly)(例如，高于70%和高達(dá)100% )，這是I2S 的活性所需要的。此外，根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的重組I2S酶具有獨(dú)特的特征，例如唾液酸含量和 聚糖圖譜，這可以提高重組I2S蛋白的生物利用度。此外，無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)系統(tǒng)簡(jiǎn)化了下游 純化工藝，并減少或消除了血清來(lái)源的污染物如胎球蛋白。因此，本發(fā)明提供了大規(guī)模生產(chǎn) 系統(tǒng)，該系統(tǒng)是更有效、具有成本效益、可重復(fù)的、更安全并產(chǎn)生更有效力的重組I2S。
[0011]因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)在含有缺乏血清的培養(yǎng)基的大規(guī)模培養(yǎng)皿 中懸浮培養(yǎng)共表達(dá)重組I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶（FGE)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞而用于在哺乳 動(dòng)物細(xì)胞中大規(guī)模產(chǎn)生重組艾杜糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白的方法。在一些實(shí)施方案中， 培養(yǎng)步驟包括灌注工藝。
[0012] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中大規(guī)模產(chǎn)生重組艾杜 糖-2-硫酸酯酶（I2S)蛋白的方法，所述方法包括在一定條件下，在含有缺乏血清的培養(yǎng)基 的大規(guī)模培養(yǎng)皿中培養(yǎng)共表達(dá)重組I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶（FGE)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞， 以便所述細(xì)胞平均以大于約15皮克/細(xì)胞/日的比生產(chǎn)率產(chǎn)生重組I2S蛋白，并且另外地 其中產(chǎn)生的重組I2S蛋白平均包含至少約60%的對(duì)應(yīng)于人I2S蛋白的Cys59的半胱氨酸殘 基至C a-甲酰甘氨酸的轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)步驟包括灌注工藝。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，灌注工藝具有在約0. 5-2體積的新鮮培養(yǎng)基/反應(yīng)器的工作 體積 / 日（WD)(例如，約 0· 5-1. 5VVD、約 0· 75-1. 5VVD、約 0· 75-1. 25VVD、約 L 0-2. 0VVD、約 I. O-L 9VVD、約 I. O-L 8VVD、約 I. O-L 7VVD、約 I. O-L 6VVD、約 I. O-L 5VVD、約 I. O-L 4VVD、 約1. 0-1. 3VVD、約1. 0-1. 2VVD、約1. 0-1. 1VVD)的范圍內(nèi)的灌注速率。在一些實(shí)施方案 中，灌注工藝具有約 〇· 5、0· 55、0· 6、0· 65、0· 7、0· 75、0· 8、0· 85、0· 9、0· 95、1· 0、1· 05、1· 10、 1. 15、1· 2、1· 25、1· 3、1· 35、1· 4、1· 45、1· 5、1· 55、1· 6、1· 65、1· 7、1· 75、1· 8、1· 85、1· 9、1· 95 或2. OVVD的灌注速率。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，灌注工藝具有在約0.05-5納升每種細(xì)胞每日（nL/細(xì)胞/ 日）（例如，約〇· 〇5-4nL/細(xì)胞/日、約0· 05-3nL/細(xì)胞/日、約0· 05-2nL/細(xì)胞/日、約 0· 05-lnL/細(xì)胞/日、約0· l-5nL/細(xì)胞/日、約0· l-4nL/細(xì)胞/日、約0· l-3nL/細(xì)胞/ 日、約0· l-2nL/細(xì)胞/日、約0· I-InL/細(xì)胞/日、約0· 15-5nL/細(xì)胞/日、約0· 15-4nL/ 細(xì)胞/日、約〇· 15_3nL/細(xì)胞/日、約0· 15-2nL/細(xì)胞/日、約0· 15-lnL/細(xì)胞/日、約 0· 2-5nL/細(xì)胞/日、約0· 2-4nL/細(xì)胞/日、約0· 2-3nL/細(xì)胞/日、約0· 2-2nL/細(xì)胞/日、 約0· 2-lnL/細(xì)胞/日、約0· 25-5nL/細(xì)胞/日、約0· 25-4nL/細(xì)胞/日、約0· 25-3nL/細(xì)胞/ 日、約0· 25-2nL/細(xì)胞/日、約0· 25-lnL/細(xì)胞/日、約0· 3-5nL/細(xì)胞/日、約0· 3-4nL/細(xì) 胞/日、約0· 3-3nL/細(xì)胞/日、約0· 3-2nL/細(xì)胞/日、約0· 3-lnL/細(xì)胞/日、約0· 35-5nL/ 細(xì)胞/日、約〇· 35-4nL/細(xì)胞/日、約0· 35-3nL/細(xì)胞/日、約0· 35-2nL/細(xì)胞/日、約 0· 35-lnL/細(xì)胞/日、約0· 4-5nL/細(xì)胞/日、約0· 4-4nL/細(xì)胞/日、約0· 4-3nL/細(xì)胞/日、 約0· 4-2nL/細(xì)胞/日、約(λ 4-lnL/細(xì)胞/日、約(λ 45-5nL/細(xì)胞/日、約(λ 45-4nL/細(xì)胞/ 日、約(λ 45-3nL/細(xì)胞/日、約(λ 45-2nL/細(xì)胞/日、約(λ 45-lnL/細(xì)胞/日、約(λ 5-5nL/細(xì) 胞/日、約0· 5-4nL/細(xì)胞/日、約0· 5-3nL/細(xì)胞/日、約0· 5-2nL/細(xì)胞/日、約0· 5-lnL/ 細(xì)胞/日）的范圍內(nèi)的細(xì)胞比灌注速率。在一些實(shí)施方案中，灌注工藝具有約0.05、0. 1、 0. 15、0. 2、0. 25、0. 3、0. 35、0. 4、0. 45、0. 5、0. 55、0. 6、0. 65、0. 7、0. 75、0. 8、0. 85、0. 9、0. 95、 1. 0、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、1. 7、1. 8、1. 9、2. 0、2. 1、2. 2、2. 3、2. 4、2. 5、2. 6、2. 7、2. 8、 2. 9、3. 0、3. 1、3. 2、3. 3、3. 4、3. 5、3. 6、3. 7、3. 8、3. 9、4. 0、4. 1、4. 2、4. 3、4. 4、4. 5、4. 6、4. 7、 4. 8、4. 9或5. OnL/細(xì)胞/日的細(xì)胞比灌注速率。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞平均以大于約20皮克/細(xì)胞/日（例 如，大于約 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 皮克 /細(xì)胞 / 日）的 比生產(chǎn)率產(chǎn)生重組I2S蛋白。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)的細(xì)胞以至少6mg每升 每日（mg/L/ 日）（例如，至少 8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、 80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或50011^/1/日或更多）的平均收獲滴度 產(chǎn)生重組I2S蛋白。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法的產(chǎn)生的重組I2S蛋白包含至少約70% (例如，至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%)的對(duì)應(yīng)于人123 蛋白的Cys59的半胱氨酸殘基至C a-甲酰甘氨酸（FGly)的轉(zhuǎn)化。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，適合于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中， 適合于本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，適合于本發(fā)明的大規(guī)模培養(yǎng)皿為生物反應(yīng)器。在一些實(shí)施方 案中，適合的生物反應(yīng)器為或大于10L、200L、500L、1000L、1500L、2000L、2500L、3000L的規(guī) 模。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，適合于本發(fā)明的培養(yǎng)基缺乏動(dòng)物來(lái)源的組分。在一些實(shí)施方 案中，適合的培養(yǎng)基是化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，適合的培養(yǎng)基不含蛋白 質(zhì)。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，適合于本發(fā)明的培養(yǎng)基包含至少一種氧化還原調(diào)節(jié)劑。在 一些實(shí)施方案中，適合于本發(fā)明的氧化還原調(diào)節(jié)劑選自谷胱甘肽、葡萄糖-6-磷酸、肌肽、 鼠尾草酚、蘿卜硫素、生育酚、抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、硒、2-巰基乙醇、N-乙酰半胱氨 酸、半胱氨酸、核黃素、煙酸、葉酸、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 磷酸（NADP)及其組合。在一些實(shí)施方案中，適合的氧化還原調(diào)節(jié)劑為半胱氨酸。在一 些實(shí)施方案中，半胱氨酸的濃度在約〇· lmg/L至約65mg/L(例如，l-50mg/L、l-40mg/L、 l-30mg/l、l-20mg/L、l-10mg/L)的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，適合的氧化還原調(diào)節(jié)劑 為2-巰基乙醇。在一些實(shí)施方案中，2-巰基乙醇的濃度在約O.OOlmM至約O.OlmM(例 如，約 0.001-0. 008mM、約 0.001-0. 007mM、約 0.001-0. 006mM、約 0.001-0. 005mM、約 0. 001-0. 004mM、約0. 001-0. 003mM、約0. 001-0. 002mM)的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，適合 的氧化還原調(diào)節(jié)劑為N-乙酰半胱氨酸。在一些實(shí)施方案中，N-乙酰半胱氨酸的濃度在約 3mM至約9mM (例如，約3-8mM、約3-7mM、約3-6mM、約3-5mM、約3-4mM)的范圍內(nèi)。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，適合本發(fā)明的培養(yǎng)基包含至少一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施 方案中，適合的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為次黃嘌呤。在一些實(shí)施方案中，次黃嘌呤的濃度在約0. ImM至 約 IOmM (例如，約 0· l-9mM、約 0· l-8mM、約 0· l-7mM、約 0· l-6mM、約 0· l-5m