" I2S蛋白"以及語法等同物可互換使用。
[0090] 通常情況下，人I2S蛋白作為前體形式產(chǎn)生。人I2S的前體形式包含信號肽（全 長前體的氨基酸殘基1-25)、原肽（全長前體的氨基酸殘基26-33)和一條鏈（全長前體的 殘基34-550)，所述鏈可被進一步加工成42kDa的鏈（全長前體的殘基的34-455)和HkDa 的鏈（全長前體的殘基446-550)。通常情況下，前體形式也稱為全長前體或全長I2S蛋白， 其含有550個氨基酸。已除去信號肽的成熟形式的氨基酸序列（SEQ ID NO :1)和典型野生 型或天然存在的人I2S蛋白的全長前體的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)示于表1中。信號肽 加以下劃線。此外，人I2S蛋白同種型a和b前體的氨基酸序列也分別提供于表1中的SEQ ID NO :3 和 4。
[0091] 表1.人艾杜糖-2-硫酸酯酶
[0092]
【主權(quán)項】
1. 一種用于在哺乳動物細胞中大規(guī)模產(chǎn)生重組艾杜糖2-硫酸酯酶（I2S)蛋白的方法， 所述方法包括在含有缺乏血清的培養(yǎng)基的大規(guī)模培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)共表達重組I2S蛋白 和甲酰甘氨酸生成酶（FGE)的哺乳動物細胞。
2. -種用于在哺乳動物細胞中大規(guī)模產(chǎn)生重組艾杜糖2-硫酸酯酶（I2S)蛋白的方法， 所述方法包括在一定條件下，在含有缺乏血清的培養(yǎng)基的大規(guī)模培養(yǎng)皿中培養(yǎng)共表達重組 I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶（FGE)的哺乳動物細胞，以便所述細胞平均以大于約15皮克 /細胞/日的比生產(chǎn)率產(chǎn)生所述重組I2S蛋白，并且另外地其中所述產(chǎn)生的重組I2S蛋白平 均包含至少約60%的對應于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸殘基至C a-甲酰甘氨酸 的轉(zhuǎn)化。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述培養(yǎng)步驟包括灌注工藝。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述灌注工藝具有在約0. 5-2體積的新鮮培養(yǎng)基 /反應器的工作體積/日（VVD)的范圍內(nèi)的灌注速率。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述灌注工藝具有在約0. 05-5納升每種細胞每日 (nL/細胞/日）的范圍內(nèi)的細胞比灌注速率。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞平均以大于約30皮克/細胞 /日的比生產(chǎn)率產(chǎn)生所述重組I2S蛋白。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞以至少6mg每升每日的平均 收獲滴度產(chǎn)生所述重組I2S蛋白。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述產(chǎn)生的重組I2S蛋白平均包含至 少約70%的對應于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸殘基至C a-甲酰甘氨酸的轉(zhuǎn)化。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述產(chǎn)生的重組I2S蛋白包含至少約 80%的對應于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸殘基至FGly的轉(zhuǎn)化。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述產(chǎn)生的重組I2S蛋白包含至少 約97%的對應于人I2S蛋白的Cys59的所述半胱氨酸殘基至C a-甲酰甘氨酸（FGly)的轉(zhuǎn) 化。
11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞為人細胞。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述哺乳動物細胞為CHO細胞。
13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述大規(guī)模培養(yǎng)皿為生物反應器。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述生物反應器為或大于10L、200L、500L、 1000L、1500L 或 2000L 的規(guī)模。
15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基缺乏動物來源的組分。
16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基為化學成分確定的培養(yǎng) 基。
17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基不含蛋白質(zhì)。
18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少一種氧化還原 調(diào)節(jié)劑。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述至少一種氧化還原調(diào)節(jié)劑選自谷胱甘肽、 葡萄糖-6-磷酸、肌肽、鼠尾草酚、蘿卜硫素、生育酚、抗壞血酸、脫氫抗壞血酸、硒、2-巰基 乙醇、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、核黃素、煙酸、葉酸、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD)和煙酰 胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述至少一種氧化還原調(diào)節(jié)劑包括半胱氨酸。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述半胱氨酸的濃度在約0. lmg/L至約65mg/L 的范圍內(nèi)。
22. 根據(jù)權(quán)利要求18-21中任一項所述的方法，其中所述至少一種氧化還原調(diào)節(jié)劑包 括2-巰基乙醇。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述2-巰基乙醇的濃度在約0. OOlmM至約 0. OlmM的范圍內(nèi)。
24. 根據(jù)權(quán)利要求18-23中任一項所述的方法，其中所述至少一種氧化還原調(diào)節(jié)劑包 括N-乙酰半胱氨酸。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述N-乙酰半胱氨酸的濃度在約3mM至約9mM 的范圍內(nèi)。
26. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含至少一種生長調(diào)節(jié) 劑。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一種生長調(diào)節(jié)劑包括次黃嘌呤。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述次黃嘌呤的濃度在約0. ImM至約10mM的范 圍內(nèi)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求26-28中任一項所述的方法，其中所述至少一種生長調(diào)節(jié)劑包括胸 苷。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述胸苷的濃度在約ImM至約lOOmM的范圍內(nèi)。
31. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)基具有在約6. 8-7. 5的范 圍內(nèi)的pH。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述培養(yǎng)基具有在約6. 9-7. 3的范圍內(nèi)的pH。
33. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述培養(yǎng)步驟包括生長期和生產(chǎn)期。
34. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中于在30-37°C的范圍內(nèi)的溫度下培 養(yǎng)所述哺乳動物細胞。
35. 根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的方法，其中在所述生長期和所述生產(chǎn)期期間在不同的 溫度下培養(yǎng)所述哺乳動物細胞。
36. 根據(jù)權(quán)利要求33-35中任一項所述的方法，其中用于所述生長期和所述生產(chǎn)期的 所述培養(yǎng)基具有不同的pH。
37. 根據(jù)權(quán)利要求33-36中任一項所述的方法，其中在所述生產(chǎn)期期間以在約1. 0-50X 1〇6個活細胞/mL的范圍內(nèi)的活細胞密度維持所述哺乳動物細胞。
38. 根據(jù)權(quán)利要求33-37中任一項所述的方法，其中所述生產(chǎn)期持續(xù)約5-90日。
39. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述方法還包括收獲所述重組I2S 蛋白的步驟。
40. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述重組I2S蛋白包含與SEQ ID NO: 1具有至少70%的同一性的氨基酸序列。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中所述重組I2S蛋白包含與SEQ ID NO: 1相同的 氨基酸序列。
42. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述FGE包含與SEQ ID NO: 5具有至 少70%的同一性的氨基酸序列。
43. 根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述FGE包含與SEQ ID NO:5相同的氨基酸序 列。
44. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞包含一個或多個編碼所述 重組I2S蛋白和/或所述FGE的外源核酸。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述一個或多個外源核酸被整合到所述細胞的 基因組中。
46. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述一個或多個外源核酸存在于一個或多個染 色體外構(gòu)建體上。
47. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞過表達所述重組I2S蛋白。
48. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞過表達所述FGE。
49. 一種重組艾杜糖2-硫酸酯酶（I2S)蛋白，其利用根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述 的方法產(chǎn)生。
50. -種重組艾杜糖2-硫酸酯酶（I2S)蛋白的制劑，所述重組I2S蛋白具有與SEQ ID NO: 1具有至少70%的同一性的氨基酸序列，并且包含至少約70%的對應于SEQ ID NO: 1的 Cys59的所述半胱氨酸殘基至Ca-甲酰甘氨酸（FGly)的轉(zhuǎn)化。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的制劑，其中所述重組I2S蛋白包含至少約80%的對應于 SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸殘基至FGly的轉(zhuǎn)化。
52. 根據(jù)權(quán)利要求50或51所述的制劑，其中所述重組I2S蛋白包含至少約90%的對 應于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸殘基至FGly的轉(zhuǎn)化。 5 3.根據(jù)權(quán)利要求50-5 2中任一項所述的制劑，其中所述重組12 S蛋白包含至少約 95%的對應于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸殘基至FGly的轉(zhuǎn)化。
54. 根據(jù)權(quán)利要求50-53中任一項所述的制劑，其中所述重組12S蛋白包含至少約 97%的對應于SEQ ID NO: 1的Cys59的所述半胱氨酸殘基至FGly的轉(zhuǎn)化。
55. 根據(jù)權(quán)利要求50-54中任一項所述的制劑，其中所述重組I2S蛋白具有至少40U/ mg的比活性，如通過使用肝素二糖作為底物的體外硫酸酯釋放活性測定所測定的。
56. 根據(jù)權(quán)利要求50-55中任一項所述的制劑，其中所述重組I2S蛋白具有至少60U/ mg的比活性，如通過使用肝素二糖作為底物的體外硫酸酯釋放活性測定所測定的。
57. 根據(jù)權(quán)利要求50-56中任一項所述的制劑，其中所述重組I2S蛋白具有至少80U/ mg的比活性，如通過使用肝素二糖作為底物的體外硫酸酯釋放活性測定法所測定的。
58. 根據(jù)權(quán)利要求50-57中任一項所述的制劑，其中所述重組I2S蛋白包含與SEQ ID NO: 1具有至少70%的同一性的氨基酸序列。
59. 根據(jù)權(quán)利要求50-58中任一項所述的制劑，其中所述重組I2S蛋白包含與SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列。
60. -種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求50-59中任一項所述的重組I2S蛋白和藥學 上可接受的載體。
61. -種治療亨特綜合癥的方法，所述方法包括向需要治療的受試者施用根據(jù)權(quán)利要 求60所述的藥物組合物。
【專利摘要】本發(fā)明除其它事項以外提供了在無血清培養(yǎng)基中使用哺乳動物細胞的懸浮培養(yǎng)大規(guī)模產(chǎn)生重組I2S蛋白的方法和組合物。具體地，本發(fā)明使用共表達重組I2S蛋白和甲酰甘氨酸生成酶(FGE)的哺乳動物細胞。
【IPC分類】C12P21-02
【公開號】CN104583414
【申請?zhí)枴緾N201380042616
【發(fā)明人】C·張, F·博爾戈
【申請人】夏爾人類遺傳性治療公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2013年6月28日
【公告號】CA2877492A1, EP2867367A1, US20140004097, WO2014005036A1...