新型il-17r-ecd突變體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本文描述的主題涉及突變型IL17RA-ECD肽，及其在炎性障礙的治療和/或預(yù)防中 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 白細胞介素17 (IL-17)是由六個成員（IL17A-F)組成的促炎細胞因子家 族。hIL-17A由⑶4T細胞的獨特譜系（Th-17)表達，并且已知刺激成纖維細胞、 內(nèi)皮細胞、上皮細胞和巨噬細胞產(chǎn)生多重促炎介質(zhì)。這些介質(zhì)包括IL-1、IL-6、 TNF- a、NOS-2 和趨化因子，導(dǎo)致炎癥的誘導(dǎo)（Aggarwal, S. Journal of Biological Chemistry278, 1910-1914(2003))。來自動物研宄的證據(jù)指示，hIL-17A 和 hIL-17F 對于協(xié)調(diào)針對哺乳動物中的某些細菌和真菌的局部宿主防御是關(guān)鍵的。近期研宄也 顯示hIL-17活躍涉及人中的一系列病理狀況，范圍從常見的哮喘到幾種自身免疫疾 病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀肩病和炎性腸病，以及變應(yīng)原特異性免疫應(yīng)答（Kolls，J. K. Immunity21, 467-476(2004) ；Iwakura, Y. The Journal of Clinical Investigati onll6, 1218-1222 (2006) ;Nakae，S.等人 Immunityl7, 375-387(2002))。hIL-17 在幾 個細胞類型中的信號傳導(dǎo)通過與內(nèi)源hIL-17受體（hIL-17R)結(jié)合而介導(dǎo)，所述內(nèi)源 hIL-17 受體含有五個受體類型，IL-17RA-IL_17RE(Aggarwal，S· Journal of Leukocyte Biology71, 1-8 (2002))。近來顯示 hIL-17A 信號傳導(dǎo)通過含有 hIL-17RA 和 hIL-17RC 鏈的異聚復(fù)合物介導(dǎo)（Toy,D.等人 The Journal of Immunologyl77,36-39(2006))〇 兩種受體均為?90kDa的單次跨膜蛋白質(zhì)，并且含有保守結(jié)構(gòu)基序（Kramer, J. Μ·等人 The Journal of Immunologyl79,6379-6383 (2007) ;Gaffen，S.L. Nat Rev Immunol9, 556-567 (2009) )。IL-17R受體與任何已知受體均不同源，并且具有獨特的信號 傳導(dǎo)性質(zhì)，這使Th-17細胞能夠充當(dāng)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)細胞之間的橋梁（Ely，L. K.，Nat ImmunollO, 1245-1251(2009))。
[0003] 與hIL-17F結(jié)合的hIL-17RA細胞外結(jié)構(gòu)域（ECD)的晶體結(jié)構(gòu)近期已得 到公開，揭示關(guān)于IL-17配體和受體相互作用的分子基礎(chǔ)的新了解（Ely，L.K.，Nat ImmunollO, 1245-1251(2009))。檢測到在結(jié)合界面處的三個主要相互作用位點，即 Thr25-Trp31 (位點 1)、Leu86-Arg93 (位點 2)和 Cys259-Arg265 (位點 3)，位點 2 是復(fù)合 物的最突出界面（Ely, L.K·，Nat Immunol 10, 1245-1251 (2009))。結(jié)構(gòu)顯示與二聚 hIL-17F 細胞因子結(jié)合的一個hIL-17RA，留下第二潛在受體結(jié)合界面與第二受體自由接合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明人已就相對于野生型受體增強的親和力、熱穩(wěn)定性和生物活性改造了可溶 性IL17受體。因此，本文描述的經(jīng)改造的可溶性hIL-17RA受體可用于治療和/或預(yù)防例 如涉及hIL-17活性的炎癥以及多種炎性障礙。
[0005] 抑制細胞中的下游IL17A誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)事件且對hIL-17具有高親和力的經(jīng)改 造的可溶性hIL-17RA受體已得到開發(fā)。生成hIL17RA細胞外結(jié)構(gòu)域的突變體文庫，表達且 篩選相對于野生型IL17RA可溶性受體對hIL17A具有增加的結(jié)合親和力的突變體。在大腸 桿菌（E. coli)細胞中顯示增加表達的所選變體還在哺乳動物細胞中表達，純化和檢查。發(fā) 現(xiàn)兩個hIL17RA-ECD變體V3和VlO是更熱穩(wěn)定的，并且相對于野生型hIL17RA-ECD以高 達6倍的更高親和力結(jié)合hIL-17A。V3和VlO變體分別含有六個和五個突變，所述突變主 要在遠離活性位點的蛋白表面上發(fā)現(xiàn)。這些變體還使用基于細胞的測定就hIL-17A誘導(dǎo)的 人成纖維細胞的CXCLl和IL-6分泌抑制進行檢查。V3和VlO均在比野生型hIL17RA-E⑶ 更低的濃度下抑制hIL-17A誘導(dǎo)的人成纖維細胞的IL-6和CXCLl分泌。這些新近發(fā)現(xiàn)的 IL17RA突變體是用于治療障礙的有用治療劑，所述障礙涉及hIL-17A活性，包括例如炎癥 和/或炎性障礙。
[0006] 本文描述的主題涉及包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的氨基 酸序列組成的IL17RA-ECD突變體。
[0007] 本文描述的主題還提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的 氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第10位是脯氨酸。
[0008] 另外，本文描述的主題提供了包含SEQ ID N0:37的氨基酸序列或由SEQ ID N0:37 的氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第15位是谷氨酸。
[0009] 此外，本文描述的主題提供了包含SEQ ID N0:37的氨基酸序列或由SEQ ID N0:37 的氨基酸序列組成的IL17RA-E⑶突變體，其中SEQ ID NO: 37的第44位是天冬酰胺。
[0010] 本文描述的主題提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的氨 基酸序列組成的IL17RA-E⑶突變體，其中SEQ ID NO:37的第45位是纈氨酸或異亮氨酸。
[0011] 本文描述的主題還提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的 氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第56位是組氨酸。
[0012] 本文描述的主題提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的氨 基酸序列組成的IL17RA-E⑶突變體，其中SEQ ID NO:37的第60位是亮氨酸或纈氨酸。
[0013] 再進一步地，本文描述的主題提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第97位是賴氨酸。
[0014] 本文描述的主題提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的氨 基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第109位是賴氨酸。
[0015] 本文描述的主題還提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的 氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第123位是甘氨酸。
[0016] 本文描述的主題再進一步提供了包含SEQ ID N0:37的氨基酸序列或由SEQ ID N0:37的氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID N0:37的第156位是天冬氨 酸。
[0017] 本文描述的主題提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的氨 基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第157位是脯氨酸。
[0018] 本文描述的主題提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的氨 基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第240位是絲氨酸。
[0019] 本文描述的主題還提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的 氨基酸序列組成的IL17RA-E⑶突變體，其中SEQ ID NO: 37的第244位是色氨酸或精氨酸。
[0020] 本文描述的主題還提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的 氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第249位是組氨酸。
[0021] 再進一步地，本文描述的主題提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO:37的氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第268位是纈氨酸。
[0022] 本文描述的主題還提供了包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 37的 氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體，其中SEQ ID NO:37的第271位是脯氨酸。
[0023] 本文描述的主題還提供了包含SEQ ID NO. :1的氨基酸序列或由SEQ ID NO. :1的 氨基酸序列組成的IL17RA-E⑶突變體，其中所述SEQ ID NO. :1具有選自下述的至少一個 置換：在第10位處的亮氨酸由脯氨酸置換，在第15位處的脯氨酸由谷氨酸置換，在第44位 處的天冬氨酸由天冬酰胺置換，在第45位處的亮氨酸由纈氨酸置換，在第45位處的亮氨酸 由異亮氨酸置換，在第56位處的谷氨酰胺由組氨酸置換，在第60位處的苯丙氨酸由亮氨酸 置換，在第60位處的苯丙氨酸由纈氨酸置換，在第97位處的精氨酸由賴氨酸置換，在第109 位處的精氨酸由賴氨酸置換，在第123位處的天冬氨酸由甘氨酸置換，在第156位處的組氨 酸由天冬氨酸置換，在第157位處的丙氨酸由脯氨酸置換，在第240位處的精氨酸由絲氨酸 置換，在第244位處的甘氨酸由色氨酸置換，在第244位處的甘氨酸由精氨酸置換，在第249 位處的谷氨酰胺由組氨酸置換，在第268位處的丙氨酸由纈氨酸置換，和在第271位處的絲 氨酸由脯氨酸置換。
[0024] 再進一步地，本文描述的主題提供了具有至少兩個置換的IL17RA-E⑶突變體。
[0025] 另外，本文描述的主題提供了具有至少七個或更少置換的IL17RA-E⑶突變體。
[0026] 本文描述的主題提供了包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列或SEQ ID NO: 11的氨基酸 序列或者由SEQ ID N0:4的氨基酸序列或SEQ ID N0:11的氨基酸序列組成的IL17RA-ECD 突變體。
[0027] 本文描述的主題還提供了包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由SEQ ID NO:4的氨 基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體。
[0028] 本文描述的主題再進一步提供了包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列或由SEQ ID NO: 11的氨基酸序列組成的IL17RA-ECD突變體。
[0029] 本文描述的主題還提供了分離的肽，所述分離的肽包含本文描述的IL17RA-E⑶ 突變體的氨基酸序列或由本文描述的IL17RA-ECD突變體的氨基酸序列組成。
[0030] 本文描述的主題提供了分離的肽，所述分離的肽包含IL17RA-E⑶突變體的氨基 酸序列或由IL17RA-ECD突變體的氨基酸序列組成，所述IL17RA-ECD突變體的氨基酸序列 與SEQ ID NOl的氨基酸序列具有至少90%同源性。
[0031] 此外，本文描述的主題提供了分離的肽，所述分離的肽包含IL17RA-E⑶突變體的 氨基酸序列或由IL17RA-ECD突變體的氨基酸序列組成，所述IL17RA-ECD突變體的氨基酸 序列與SEQ ID NOl的氨基酸序列具有至少95%同源性。
[0032] 再進一步地，本文描述的主題提供了分離的肽，所述分離的肽包含IL17RA-E⑶突 變體的氨基酸序列或由IL17RA-ECD突變體的氨基酸序列組成，所述IL17RA-ECD突變體的 氨基酸序列與SEQ ID NOl的氨基酸序列具有至少99%同源性。
[0033] 本文描述的主題提供了分離的核酸分子，所述分離的