共載納米粒子的粒徑與電位測試結(jié)果見圖6A，而形態(tài)通過透射電子顯微鏡來觀察確定，測試結(jié)果見圖6B，其中，從動態(tài)光散射柱狀圖A中可以看出陽離子聚合物載藥納米粒子與復(fù)合物納米粒子的粒徑分布均一，且無聚集現(xiàn)象及大顆粒產(chǎn)生，大約為308.0 ±52.0nm。而載藥納米粒子的透射電鏡圖示B顯示，所有的納米粒子外觀均呈現(xiàn)球形，且形態(tài)規(guī)整大小均一，在透射電鏡下顯示出載藥納米粒子的粒徑為lOOnm，其粒徑相對于DLS結(jié)果有相對差異，推斷可能是縮醛化葡聚糖表面未反應(yīng)的羥基提供了一些親水性，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)不致密，在水液中會有一些膨脹，溶液中出現(xiàn)的粒徑偏大。
[0054]實施例4
聚合物AC-DEX-PAsp (DET)-CD納米粒子的載藥量和酸敏性釋藥行為的測定(兩個分開載藥與同時負載講，載藥量及測定數(shù)據(jù)。熒光分光光度計定性，紫外分光光度計定量)
4.1熒光分光光度計定性測定藥物釋放行為
以磷酸鹽緩沖液(0.lmol/L, pH = 7.4)和醋酸鈉緩沖液(0.lmol/L, pH = 5.0)作為釋放介質(zhì)。步驟為:各取5001, lmg/mL的載藥納米粒子與雙載納米粒子溶液分別與ImL的磷酸緩沖溶液混合均勻，備用。再各取500L，lmg/mL的載藥粒子溶液于ImL的醋酸鈉緩沖液混合均勻，備用。Ih之后，用熒光分光光度計檢測載藥納米粒子和雙載納米粒子在pH =5.0和pH = 7.4緩沖介質(zhì)中熒光藥物的酸敏釋放行為，測試結(jié)果見圖7，從圖中可以看出，在釋放Ih之后,無論是載藥納米粒子還是雙納米粒子,在pH = 7.4與pH = 5.0的條件下，兩種介質(zhì)下的熒光強度幾乎都相差4-5倍，說明所設(shè)計的納米載藥系統(tǒng)具有優(yōu)秀的酸敏釋藥能力。從圖中看出聯(lián)合共載納米粒子在pH = 5.0下的釋放能力要較載藥納米粒子的少些，這可能是由于阿霉素帶有部分正電荷，參與了一部分質(zhì)粒DNA的孵育，使得藥物的釋放緩慢，同時質(zhì)粒DNA可能在某種程度上阻礙了藥物的釋放。
[0055]4.2紫外分光光度計測試藥物釋放行為
對于載藥與雙載納米粒子均采用磷酸鹽緩沖液(0.lmol/L, pH = 7.4)和醋酸鈉緩沖液(0.lmol/L, pH = 5.0)作為釋放介質(zhì),在37°C的恒溫搖床中進行體外藥物釋放。步驟為:將lmg/mL的聚合物溶液(載藥納米粒子溶液或雙載納米粒子溶液)轉(zhuǎn)移到Mw = 14K的透析袋中，并將透析袋浸入到釋放介質(zhì)分別為PH = 7.4和pH = 5.0的緩沖溶液中，在搖床上以IlOrpm的轉(zhuǎn)速孵育，每個樣三個重復(fù)。在選擇的時間間隔，于透析袋外取樣3mL，取樣后立即補加等量介質(zhì)，使其總體積保持不變。樣品中阿霉素的含量用紫外分光光度計測定在480nm波長下的吸收強度，作出藥物釋放百分含量-釋放時間的曲線圖，以標準曲線法計算得出結(jié)果。由此計算出載藥納米粒子的負載抗腫瘤藥物阿霉素的聚合物納米粒子的載藥量和包封率分別為5.2%和36.7%，同時負載抗腫瘤藥物阿霉素與質(zhì)粒DNA的雙載納米粒子的載藥量和包封率分貝為5.3%和31.86%，，藥物的體外釋放曲線見圖8，根據(jù)DOX標準曲線計算陽離子聚合物載藥納米粒子中DOX的含量，以時間對DOX累積釋放量作圖進行的分析研究。從譜圖中可以看出無論在載藥納米粒子還是聯(lián)合共載納米粒子的阿霉素的釋放行為表現(xiàn)出很好的PH響應(yīng)性。在pH值為7.4的緩沖溶液中，藥物DOX的釋放量比較緩慢，30h小時釋放率約為12%，表明聚合物納米粒子可以很好的保護藥物，減少DOX在體內(nèi)循環(huán)過程中的泄露，提高生物利用度，降低毒副作用。而在pH = 5.0的醋酸緩沖介質(zhì)中，DOX很快地從納米粒子中釋放出來，5小時的釋放量就已經(jīng)達到26%，釋放速率明顯高于pH = 7.4的磷酸緩沖介質(zhì)。這是由于由縮醛化葡聚糖組成的疏水性內(nèi)核在酸性條件下逐漸水解，轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性物質(zhì)，陽離子聚合物納米粒子結(jié)構(gòu)變得松散，從而使得藥物快速的釋放出來。
[0056]以上測試結(jié)果表明酸敏型兩嵌段聚合物載體材料具有顯著的酸敏感性，其反應(yīng)性酸敏內(nèi)核在酸性條件下可迅速由疏水性變?yōu)橛H水性，快速釋放藥物和DNA，可以達到智能控釋的。同時該酸敏型兩嵌段聚合物可以通過雙乳化的方式同時負載質(zhì)粒DNA和藥物，且有較好的負載率，顯示出聯(lián)合腫瘤化療和基因治療產(chǎn)生協(xié)同作用的可能性。
【主權(quán)項】
1.一種可降解的酸敏型聚天冬酰胺共聚物，其特征在于，所述的共聚物的親水段為多乙烯亞胺接枝的聚天冬氨酸，所述共聚物的疏水段為縮醛化葡聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚天冬酰胺共聚物，其特征在于，所述的多乙烯亞胺接枝的聚天冬氨酸與縮醛化葡聚糖的分子量的比為1:1?10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚天冬酰胺共聚物，其特征在于，所述的多乙烯亞胺為直鏈型多乙烯亞胺，分子量為100?500g/mol。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚天冬酰胺共聚物，其特征在于，所述聚天冬氨基酸芐酯為單體單元為帶有活性側(cè)基的L型天冬氨酸芐酯，所述的聚天冬氨酸芐酯的分子量為3602g/moL0
5.一種權(quán)利要求1所述的聚天冬酰胺共聚物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 51.端醛基葡聚糖與丙炔胺反應(yīng)，制備出端炔基葡聚糖； 52.根據(jù)預(yù)期共聚物中疏水端縮醛化葡聚糖的分子量，將端炔基葡聚糖的羥基在規(guī)定時間內(nèi)進行縮醛化反應(yīng)，得到疏水性的縮醛化葡聚糖； 53.端疊氮的丙胺引發(fā)L型天冬氨酸卞酯的N-羧酸酐開環(huán)聚合，制備端疊氮的聚天冬氨酸節(jié)酯； 54.利用點擊化學(xué)反應(yīng)，將S2的得到的疏水性的縮醛化葡聚糖和S3所得的端疊氮的聚天冬氨酸芐酯結(jié)合，得到縮醛化葡聚糖-聚天冬氨酸芐酯； 55.通過胺解反應(yīng)，將多乙烯亞胺連接到S4所得的縮醛化葡聚糖-聚天冬氨酸芐酯的聚氨基酸側(cè)鏈，引入多乙烯亞胺親水基團，得到最終產(chǎn)物縮醛化葡聚糖-多乙烯亞胺接枝聚天冬酰胺共聚物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的聚天冬酰胺共聚物的制備方法，其特征在于，S2所述的縮醛化反應(yīng)為用二甲氧基丙烯在吡啶對甲苯磺酸的作用下對端炔基葡聚糖的羥基進行縮醛化反應(yīng)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可降解的酸敏型聚天冬酰胺共聚物的合成及作為藥物和基因共傳輸納米粒子的制備方法。本發(fā)明的親疏水段分別由多乙烯亞胺接枝的聚天冬氨酸和縮醛化葡聚糖組成，對應(yīng)的分子量比為1:1~10。本發(fā)明的制備方法是先將葡聚糖經(jīng)過縮醛化反應(yīng)，而后與端疊氮的聚天冬氨酸芐酯結(jié)合，通過芐酯的胺解反應(yīng)鍵接多乙烯亞胺，制備出同時具有酸敏特性與降解性能的縮醛化葡聚糖-多乙烯亞胺接枝聚天冬氨酸衍生物。本發(fā)明的聚合物可以通過雙乳化的方式形成粒徑均一且穩(wěn)定的納米粒子，可聯(lián)合負載藥物和基因并靶向性同時輸送到腫瘤細胞，達到腫瘤化療和基因治療的協(xié)同效果，在腫瘤的治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K47-36, A61P35-00, C08B37-02, C08G69-14, C08G81-00
【公開號】CN104592522
【申請?zhí)枴緾N201410597695
【發(fā)明人】戴箭, 李倩倩, 陳維聰
【申請人】中山大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年10月30日