重組系統(tǒng)的制作方法【專利說明】重組系統(tǒng)發(fā)明領域[0001]本發(fā)明涉及在靶位點進行重組的方法。所述方法還涉及根據(jù)在體內進行的本發(fā)明方法制備的細胞。[0002]發(fā)明背景[0003]不同的細胞類型可以用于不同的工業(yè)目的。例如哺乳動物細胞系用于抗體生產；真菌細胞是生產多肽和次級代謝物的優(yōu)選生物；細菌細胞優(yōu)選用于小的代謝物和抗體的生產；植物細胞優(yōu)選用于口味和風味化合物。[0004]重組技術廣泛用于這樣的細胞和/或使用這樣的細胞的方法的生產力的最優(yōu)化。這可涉及大量的選擇，包括但是不限于過表達感興趣的基因，競爭途徑的缺失或失活，改變酶的區(qū)室化（compartmentalization)，增加蛋白或代謝物分泌，增加細胞器含量(organellecontent)等。[0005]就絲狀真菌而言，可獲得的可選擇標記有限使新細胞系的構建復雜化。典型地，靶序列在體外被改變以產生帶有插入的抗生素抗性標記的突變等位基因。然而，鑒于大規(guī)模使用攜帶抗性基因的生產菌株將這種基因擴散到生物圈的潛在風險，大多數(shù)國家的監(jiān)管機構反對使用抗生素抗性標記。此外，適用于絲狀真菌的可選擇標記數(shù)量有限。[0006]因此，可需要除去可選擇標記基因以使生產菌株可以在商業(yè)上使用和/或以使同樣的標記基因可以在連續(xù)的菌株修飾中再循環(huán)利用。[0007]發(fā)明概沭[0008]本發(fā)明涉及在例如祀基因組內在祀位點（targetlocus)或多個祀位點（targetloci)進行重組的方法。本發(fā)明所述的重組方法導致靶位點的改變，例如在靶位點插入核酸序列?？蓪嵤┧龅姆椒ㄒ允乖诎形稽c插入新的序列并伴隨從靶位點除去現(xiàn)存的序列。也就是說，所述方法可被用于將靶位點上的序列替換為替代性序列。所述方法可方便地在宿主細胞體內實施。[0009]典型地，當在體內實施時，不對人類或動物細胞實施本發(fā)明所述的方法。也就是說，典型地不以治療方法的形式實施本發(fā)明所述的方法?？梢噪x體或體外方式實施本發(fā)明所述的方法。術語離體或體外應被理解為包括對微生物（對完整活細胞或非細胞物質二者）實施的方法，但排除對人類或動物實施的方法。[0010]典型地，實施所述方法使至少部分插入在靶位點的序列隨后被移除。如果實施所述的方法以在靶位點替換序列并隨后移除插入的序列，那么結果可以是使靶位點的序列缺失。[0011]因此，可實施本發(fā)明所述的方法以改變靶位點的序列。這種改變可以是，例如添加新的序列、置換現(xiàn)存的序列和/或缺失/去除現(xiàn)存的序列。[0012]典型地，本發(fā)明在宿主細胞體內進行。宿主細胞可以優(yōu)選地是生產感興趣的化合物的細胞。宿主細胞可以在應用本發(fā)明方法之前能夠生產感興趣的化合物。在這種情況下，本發(fā)明的方法可以用于修飾靶位點以使通過宿主細胞的感興趣的化合物的生產改變，例如可以增加產量?；蛘?，宿主細胞可以是由于應用本發(fā)明的方法而生產感興趣的化合物的細胞。[0013]因此根據(jù)本發(fā)明，提供了在靶位點進行重組的方法，該方法包括：[0014]-提供兩種或更多種核酸，它們總共包含：（a)能夠與靶位點側翼序列同源重組的序列；(b)兩個或更多個位點特異性重組位點；（c)編碼識別位點特異性重組位點的重組酶的序列；和（d)編碼標記的序列，[0015]其中所述兩種或更多種核酸能夠相互同源重組從而產生單一核酸，并且[0016]其中所述兩種或更多種核酸中的至少兩種各包含編碼無功能的部分標記基因的序列；以及[0017]-使所述兩種或更多種核酸相互重組以及與靶位點的側翼序列重組，以在靶位點插入編碼有功能標記和/或必需基因（essentialgene)的連續(xù)核酸序列以及編碼重組酶的序列，所述編碼標記和/或編碼重組酶的序列的側翼是至少兩個位點特異性重組位點以及所述位點特異性重組位點的側翼是能夠與靶位點的側翼序列同源重組的序列。[0018]因此，所述兩種或更多種核酸中的至少兩種各包含編碼無功能的部分標記基因的序列，各包含重組后編碼有功能標記的部分序列（并且其中所述部分自身不編碼有功能的標記）。[0019]本發(fā)明還涉及通過在體內實施的根據(jù)本發(fā)明所述的方法所產生的細胞。[0020]與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明方法的優(yōu)勢在于其允許在菌株轉化中連續(xù)使用非反向選擇標記（non-counterselectablemarker)。這是有利的，特別是在絲狀真菌中，其中已知的反向選擇標記數(shù)量有限且再循環(huán)標記用于重復使用極其重要。此外，[0021]這種系統(tǒng)允許使用單一多核苷酸中不包含完全敲除盒的載體。這避免了克隆問題，以及更穩(wěn)定的核苷酸片段（在酵母或E.coli中位點特異性重組酶不能作用于其重組位點，例如因為它們并不都存在）。[0022]而且，使用可以通過利用自動方法擴增產生的核酸片段實施本發(fā)明的方法。這導致了更高通量的更為靈活的系統(tǒng)，因為片段擴增（例如通過PCR)比限制性消化更容易自動化。[0023]利用本發(fā)明的方法可以得到極其高效的菌株構建（接近100%效率），且所述方法可被用于比使用現(xiàn)有技術更快地產生多重敲除，因為可以在一個步驟中引入和/或除去多個標記。[0024]使用本發(fā)明的方法可以更易于表征地追蹤菌株構建和修飾，因為位點特異性重組位點可以保留在祀位點（targetlocus)或多個祀位點（targetloci)。[0025]附圖簡沭[0026]圖1展示了質粒pDELNicB-3的示意圖，其是用于使A.niger中的nicB基因失活的置換盒的基礎。置換盒包含nicB的側翼區(qū)域、hygB標記盒、突變IoxP位點和E.coliDNA。在實施例部分（參見下文）可以找到關于pDELNicB-3的更多細節(jié)。[0027]圖2展示了質粒pDEL_PdxA_2的示意圖，其是用于使A.niger中的pdxA基因失活的置換盒的基礎。置換盒包含PdxA的側翼區(qū)域、ble標記盒、突變IoxP位點和E.coliDNA。在實施例部分（參見下文）可以找到關于pDEL_PdxA-2的更多細節(jié)。[0028]圖3展示了質粒pDEL_EP0_Hyg_l的示意圖，其包含使A.niger中的epo基因失活的置換盒的一部分。置換盒包含epo的側翼區(qū)域、hygB標記盒的一部分、突變IoxP位點和E.coliDNA。在實施例部分（參見下文）可以找到關于pDEL_EPO_Hyg-l的更多細節(jié)。[0029]圖4展示了質粒pDEL_EP0_CRE-l的示意圖，其包含使A.niger.中的印〇基因失活的置換盒的一部分。置換盒包含epo的側翼區(qū)域、hygB標記盒的一部分、突變IoxP位點、ere重組酶表達盒和E.coliDNA。在實施例部分（參見下文）可以找到關于pDEL_EP0_CRE-I的更多細節(jié)。[0030]圖5展示了片段產生以及A.niger中的轉化和重組中這些片段的使用的示意圖。頂部展示了利用PCR擴增產生"二重左"（"bipartiteleft"）和"二重右"（"bipartiteright"）片段。底部圖中展示了通過二重左片段和二重右片段在基因組內的同源重組轉化A.niger。[0031]圖6展示了片段產生以及A.niger中的轉化和重組中這些片段的使用的示意圖(同樣展示于圖5)。這個特定實施例中的各二重（bipartit)片段不同，因為它們另外包含Cre重組酶盒。最后的圖展示了Cre誘導的重組事件之后產生的基因組位點的布局。[0032]圖7展示了Cre誘導的側翼為IoxP的hygB選擇標記的丟失。上部板是Cre未誘導的轉化體。下部板是通過涂布在作為碳源的木糖上而使Cre被誘導。百分比展示了Cre誘導后，A.niger菌落中標記移除的百分比。[0033]圖8描述了用于在真菌中瞬時表達ere重組酶的pEBA513的圖譜。pEBA513是PAMPF21衍生的載體，其包含AMl區(qū)域和CAT氯霉素抗性基因。顯示的是ere重組酶基因(ere)表達盒，其包含A.nigerglaA啟動子（Pgla)、cre重組酶編碼區(qū)和niaD終止子。此夕卜，還展示了由A·nidulansgpdA啟動子（PgpdA)、hygB編碼區(qū)和P·chrysogenumpenDE終止子組成的潮霉素抗性盒。[0034]圖9展示了利用PCR檢測R.emersonii基因組中的pGBT0PEBA-205表達質粒。分離并利用PCR分析來自轉化體A-A4(泳道2-4)和空菌株（泳道5-7)的基因組DNA。質粒DNA被用作PCR反應的對照模板：pGBTOPEBA-4(泳道8)、pGBT0PEBA-8(泳道9)和pGBTOPEBA-205(泳道10)。在PCR反應中，加入針對pGBTOPEBA-4(泳道2、5和8,預計片段：256bp)、pGBT0PEBA-8(泳道3、6和9,預計片段：306bp)和pGBT0PEBA-205(泳道4、7和10,預計片段：452bp)的引物。泳道1和11含有分子量標記。[0035]圖10展示了無標記的R.emersonii轉化體的表型分析和PCR分析。用milliQ水(對照）或PEBA513構建體轉化轉化體A-A4以使ere重組酶瞬時表達，其中轉化體A-A4含有多拷貝的R.emersoniiCbhI和含有側翼為IoxP的ble表達盒的pDEL_Pdx-A2質粒。[0036](圖10A):生長于含lOyg/ml腐草霉素的PDA培養(yǎng)基（左側圖）和無選擇的PDA(右側圖）的轉化體和空菌株的MTP板的圖片。行A展示了A-A4的兩種milliQ對照轉化體，其中A-A4包含具有側翼為IoxP的ble表達盒（lox-ble-lox)的pDEL_Pdx-A2。行B展示了pEBA513轉化的兩種A-A4轉化體（lox-ble_lox+pEBA513)的生長。親本轉化體A-A4(lox-ble-lox，轉化前）生長于行C。最后，行D展示了空菌株的生長。[0037](圖10B):利用ere重組酶移除標記之前和之后的轉化體以及ere重組酶構建體的PCR分析。泳道2和泳道3展示了通過兩種milliQ對照A-A4轉化體的PCR分析得到的PCR片段，其中使用針對ble表達構建體中的pdx側翼的引物。如果轉化體仍然含有ble選擇標記，那么2752bp的PCR條帶是預計被擴增的PCR片段。泳道5和6展示了用pEBA513轉化的兩種A-A4轉化體的PCR分析，其中使用針對pEBA513cre重組酶表達質粒的hygB基因的引物（314bp片段）。泳道8和9展示了用pEBA513轉化的兩種A-A4轉化體的PCR片段，其中使用針對ble表達構建體的pdx側翼的引物。881bp的PCR片段指示來源于R.emersonii轉化體的ble表達盒的缺失。泳道1、4和7含有分子量標記。[0038]圖11描述了ρΕΒΑΙΟΟΙ載體。部分載體片段和pEBA1002載體聯(lián)合用于二重基因革巴向方法以使Rasamsoniaemersonii中的ReKu80ORF缺失。所述載體包含2500bp5'上游側翼區(qū)、l〇x66位點、由A.nidulansgpdA啟動子驅動的ble編碼序列的5'部分和pUC19骨架（Invitrogen，Breda,荷蘭）。轉化R.emersonii菌株之前，用限制性酶Notl消化除去E.coliDNA。[0039]圖12描述了pEBA1002載體。部分載體片段和ρΕΒΑΙΟΟΙ載體聯(lián)合用于二重基因靶向方法以使Rasamsoniaemersonii中的ReKu800RF缺失。所述載體包含ble編碼區(qū)的3'部分、A.nidulanstrpC終止子、1οχ71位點、ReKu800RF的2500bp3'下游側翼區(qū)和pUC19骨架（Invitrogen，Breda,荷蘭）。轉化R.emersonii菌株之前，用限制性酶Notl消化除去E.coliDNA。[0040]圖13描述了用于使R.emersonii的ReKu80基因缺失的策略。用于缺失ReKu80的載體包含側翼為IoxP位點的重疊無功能ble選擇標記片段（分開的標記）和用于靶向的ReKu80基因的5'和3'同源區(qū)（1)。構建體通過在基因組ReKu80位點和在重疊的同源無功能ble選擇標記片段處的三同源重組（X)進行整合（2)，并且置換基因組ReKuSO基因拷貝（3)。隨后，通過ere重組酶的瞬時表達導致1οχ66和1οχ71位點之間的重組移除選擇標記，從而使ble基因缺失且剩余雙突變的1οχ72位點留在基因組中（4)。使用這種總體策略，ReKu800RF被移除出基因組。[0041]圖14展示了ReKu80敲除菌株的Southern印跡分析。從菌株中分離基因組DNA,然后用限制性酶HindIII消化。使用針對ReKu80基因的3'區(qū)的探針進行Southern印跡雜交。泳道1:野生型菌株；泳道2和3:兩種腐草霉素抗性菌株顯示出正確的ReKuSO敲除整合的片段大小；泳道4:被標記的分子量標記；泳道5和6:帶有正確的ReKu80敲除整合的片段大小的兩種腐草霉素敏感菌株。[0042]圖15描述了pEBA1005載體，它和pEBA1006載體被聯(lián)合用于二重基因靶向方法(bipartitegene-targetingmethod)以缺失Rasamsoniaemersonii中的RePepAORF0所述載體包含2500bp5'側翼區(qū)、1οχ66位點、由A.nidulansgpdA啟動子驅動的ble編碼區(qū)的5'部分和pUC19骨架（Invitrogen，Breda,荷蘭）。[0043]圖16描述了pEBA1006載體，它和pEBA1005載體被聯(lián)合用于二重基因靶向方法以缺失Rasamsoniaemersonii中的RePepA0RF。所述載體包含ble編碼區(qū)的3'部分、A.nidulanstrpC終止子、1οχ71位點、ReKu800RF的2500bp3'側翼區(qū)和pUC19骨架(Invitrogen,Breda,荷蘭）。[0044]圖17描述了用于缺失Rasamsoniaemersonii中的RePepAORF的pEBA10056載體。所述載體包含2500bp5'側翼區(qū)，1οχ66位點，由A.nidulansgpdA啟動子、ble編碼區(qū)和A.nidulanstrpC終止子組成的ble表達盒，1οχ71位點，ReKu800RF的2500bp3'側翼區(qū)和pUC19骨架（Invitrogen，Breda，荷蘭）。[0045]圖18展示了補充有1%酪蛋白鈉鹽的PDA平板圖，其具有用包含2.5kb側翼的ReP印A缺失構建體轉化的ΛReKu80-2菌株和TEC-142S。[0046]圖19展示了質粒pPepAHyg的示意圖，其包含使R.emersonii中的RePepA基因失活的置換盒的一部分。置換盒包含1500個核苷酸的ReP印A5'側翼區(qū)、hygB標記盒的一部分、突變的IoxP位點和E.coliDNA。在實施例部分（參見下文）可以找到關于pPepAHyg的更多細節(jié)。[0047]圖20展示了質粒pPepACre的示意圖，其包含使R.emersonii中的RePepA基因失活的置換盒的一部分。置換盒包含ReP印A3'側翼區(qū)、hygB標記盒的一部分、突變的IoxP位點、ere重組酶表達盒和E.coliDNA。在實施例部分（參見下文）可以找到關于pPepACre的更多細節(jié)。[0048]圖21展示了用于R.emersonii中的轉化和重組的片段的示意圖。用于缺失ReP印A的載體包含側翼為IoxP位點的重疊無功能hygB選擇標記片段（分開的標記）和用于靶向的ReP印A基因的5'和3'同源區(qū)（1)。構建體通過在基因組ReP印A位點和在重疊的同源無功能hygB選擇標記片段處的三同源重組（X)進行整合（2)，并且置換基因組ReP印A基因拷貝（3)。隨后，通過在木糖上培養(yǎng)轉化體以誘導ere重組酶的表達導致1οχ66和1οχ71位點之間的重組移除選擇標記，從而缺失hygB和Cre表達盒且剩余的雙突變的1οχ72位點留在基因組中（4)。[0049]圖22展不了Rasamsoniaemersonii中Cre誘導的側翼為IoxP的hygB選擇標記的丟失。帶有側翼為IoxP的hygB選擇標記和ere重組酶表達盒被整合至PePepA位點的轉化體被涂布在碳源為木糖的平板上以誘導ere重組酶。ere被誘導之后，將菌落轉移至無選擇的PDA(左）和潮霉素B選擇的PDA(右）?？站曜鳛檫x擇對照被包括在內。[0050]圖23展示了在S.cerevisiae中敲除ADEl基因的過程示意圖，其中使用側翼均在1οχ71和1οχ66之間的二重標記和具有誘導型啟動子的ere重組酶。[0051]序列表描沭[0052]SEQIDNO:1展示了突變的IoxP位點，1οχ66。[0053]SEQIDNO:2展示了突變的IoxP位點，1οχ71。[0054]SEQIDN0:3展示了雙突變的1οχ72位點。[0055]SEQIDN0:4展示了第一無功能的hygB標記片段（缺失hygB的3'末端編碼序列的最后27個堿基的PgpdA-HygB序列）。[0056]SEQIDNO:5展示了第二無功能的hygB片段（缺失hygB的5'末端編碼序列的開始44個堿基的HygB-TtrpC序列）。[0057]SEQIDNO:6展示了含有A.nidulans木聚糖酶A啟動子、ere重組酶和木聚糖酶A終止子的ere重組酶盒，以允許ere重組酶的木糖可誘導表達。[0058]SEQIDNO:7展示了Ble-正向PCR引物的DNA序列；[0059]SEQIDN0:8展示了Ble-反向PCR引物的DNA序列；[0060]SEQIDNO:9展示了EBA205-正向PCR引物的DNA序列；[0061]SEQIDNO:10展示了EBA205-反向PCR引物的DNA序列；[0062]SEQIDNO:11展示了pGBT0PEBA4-正向PCR引物的DNA序列；[0063]SEQIDNO:12展示了pGBT0PEBA4-反向PCR引物的DNA序列；[0064]SEQ當前第1頁1 2 3 4 5 6