越短，同源性百分比可越高。
[0165] 在本發(fā)明中，所述的兩種或更多種核酸總共包含兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)特異性重組位 點(diǎn)。這些位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)被由兩種或更多種核酸總共編碼的重組酶識(shí)別。
[0166] 所述的位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)和重組酶被選擇以使重組酶可以靶向位點(diǎn)特異性重 組位點(diǎn)，從而導(dǎo)致位于重組位點(diǎn)之間的序列被外重組。
[0167] 術(shù)語(yǔ)"重組酶"或"位點(diǎn)特異性重組酶"或其類似物指的是識(shí)別和結(jié)合至短核酸位 點(diǎn)或"位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)"（即重組酶識(shí)別位點(diǎn)）并催化與這些位點(diǎn)相關(guān)的核酸重組的酶 或重組酶。這些酶包括重組酶、轉(zhuǎn)座酶和整合酶。
[0168] "位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)"或其類似物指的是短核酸位點(diǎn)或序列（即重組酶識(shí)別 位點(diǎn)），其被序列或位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別并在位點(diǎn)特異性重組事件過(guò)程中變成交換 (crossover)區(qū)域。序列特異性重組酶祀位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于Iox位點(diǎn)、att位點(diǎn)、dif 位點(diǎn)和frt位點(diǎn)。
[0169] 本文中使用的術(shù)語(yǔ)"lox位點(diǎn)"指的是一種核苷酸序列，其中噬菌體Pl的ere基 因的產(chǎn)物（即Cre重組酶）能夠在該序列上催化位點(diǎn)特異性重組事件。本領(lǐng)域已知的多種 Iox位點(diǎn)，包括天然存在的1〇χΡ、1〇χΒ、IoxL和IoxR以及大量突變的或變體Iox位點(diǎn)，例如 1οχ66、1οχ71、1οχΡ511、1οχΡ514、1οχΛ86、ΙοχΛ 117、loxC2、1οχΡ2、1οχΡ3 和 Iox P23。
[0170] 本文中使用的術(shù)語(yǔ)"frt位點(diǎn)"指的是一種核苷酸序列，其中酵母2微米質(zhì)粒的FLP 基因的產(chǎn)物（即FLP重組酶）能夠在該序列上催化位點(diǎn)特異性重組。
[0171] 位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)可使重組酶表達(dá)后的外重組在靶位點(diǎn)產(chǎn)生不被重組酶識(shí)別 的單個(gè)突變位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。特別地，所述Iox位點(diǎn)可以是l〇x66和lox71 (Albert, Η. , Dale, Ε. C. , Lee, Ε. , &0w, D. W. (1995)). Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant Iox sites placed in the plant genome. Plant Journal,7(4), 649-659)。在一個(gè)特定的實(shí)施方式中，lox66和lox71位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)可使重組酶表 達(dá)后的外重組在靶位點(diǎn)產(chǎn)生不被重組酶識(shí)別的l〇x72突變位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)。
[0172] 本發(fā)明所實(shí)施的方法中，除了重組酶、位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)和能夠與靶位點(diǎn)的側(cè) 翼序列同源重組的序列之外，兩種或更多種核酸總共還包含編碼標(biāo)記的序列以使所述的兩 種或更多種核酸的重組導(dǎo)致所述的編碼標(biāo)記基因的序列被插入在靶位點(diǎn)。這種編碼標(biāo)記的 序列可位于至少兩種能夠與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組的序列之間。
[0173] 關(guān)鍵地，兩種或更多種核酸被提供以使至少兩種核酸各包含編碼無(wú)功能的部分標(biāo) 記編碼序列的序列。當(dāng)所述的兩種或更多種核酸被重組時(shí)，將產(chǎn)生編碼有功能標(biāo)記的連續(xù) 序列。因此，本發(fā)明的方法被稱為"分開(kāi)標(biāo)記"法。
[0174] 在本發(fā)明的上下文中，無(wú)功能指的是無(wú)法編碼能夠擔(dān)當(dāng)有功能選擇標(biāo)記的產(chǎn)物的 序列。
[0175] 典型地，可實(shí)施所述方法以使編碼標(biāo)記的序列位于兩個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)特異性重組位 點(diǎn)之間。以這種方式，標(biāo)記基因可通過(guò)重組酶的表達(dá)被外重組。因此，所述方法可被用于顯 性標(biāo)記和反向選擇標(biāo)記。
[0176] 以這種方式，可以使用相同的標(biāo)記以重復(fù)模式實(shí)施所述方法，其中所述重復(fù)模式 具有不止一個(gè)循環(huán)的與靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列的同源重組，然后在重組酶表達(dá)后外重組?？蛇M(jìn) 一步將這種方法與突變位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的使用相結(jié)合，其中一旦標(biāo)記被外重組，所述 位點(diǎn)就不能被重組酶靶向。
[0177] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于：它允許同時(shí)、連續(xù)或分別實(shí)施多個(gè)重組事件。
[0178] 因此，可使用相同的標(biāo)記以具有不止一個(gè)重組循環(huán)的重復(fù)模式實(shí)施所述方法。因 此，本發(fā)明特別適用于可供使用的標(biāo)記集合有限的情況?？蛇M(jìn)一步將這種方法與突變位點(diǎn) 特異性重組位點(diǎn)的使用相結(jié)合，其中一旦標(biāo)記被外重組，所述位點(diǎn)就不能被重組酶靶向。由 于標(biāo)記通過(guò)重組酶的激活而被消除，因此這個(gè)方法允許靶向多個(gè)位點(diǎn)且被靶向的位點(diǎn)的數(shù) 目不受不同標(biāo)記的可用性的限制。
[0179] 在本發(fā)明的方法中，兩種或更多種核酸總共可包含兩種或更多種不同的標(biāo)記編碼 序列以使所述的兩種或更多種核酸的重組導(dǎo)致所述的兩種或更多種不同的標(biāo)記基因編碼 序列被插入在靶位點(diǎn)?？商峁┠軌蚺c兩個(gè)或多個(gè)靶位點(diǎn)的側(cè)翼序列同源重組的序列以實(shí)施 這種方法。進(jìn)一步，可以使用一種標(biāo)記靶向至少兩個(gè)靶位點(diǎn)，使用不同的標(biāo)記靶向一個(gè)或多 個(gè)其它靶位點(diǎn)。
[0180] 在本發(fā)明的方法中，編碼標(biāo)記的序列之一將是分開(kāi)的。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的 實(shí)施方式中，兩種或更多種或甚至所有的編碼標(biāo)記的序列典型地都將是分開(kāi)的。也就是說(shuō)， 對(duì)于每一個(gè)標(biāo)記，兩種或更多種核酸被提供以使至少兩種核酸各包含編碼無(wú)功能的部分標(biāo) 記編碼序列的序列。所述的兩種或更多種核酸的重組產(chǎn)生編碼有功能標(biāo)記的連續(xù)序列。本 發(fā)明所述的方法可包括至少一種分開(kāi)的標(biāo)記。典型地，所用的所有編碼標(biāo)記的序列都以分 開(kāi)的形式被提供。
[0181] 可實(shí)施所述的方法以使一種或更多種相同的或不同的標(biāo)記被重組至細(xì)胞，其中每 個(gè)標(biāo)記的側(cè)翼均為Iox位點(diǎn)。然后，本發(fā)明所述的方法可被用于提供進(jìn)一步的重組事件，同 時(shí)除去所有這些標(biāo)記。
[0182] 在本發(fā)明所述的方法中，靶位點(diǎn)可包含被破壞和/或部分或全部缺失的編碼序 列。典型地，所述方法在靶位點(diǎn)增加新序列；這種新序列典型地將替換、缺失和/或修飾靶 位點(diǎn)的序列。
[0183] 如上所述，當(dāng)在宿主細(xì)胞體內(nèi)實(shí)施重組時(shí)，置換序列可以例如賦予可選擇的表型。 在這種情況下，所述置換序列包含選擇標(biāo)記。優(yōu)選地，實(shí)施這種方法以使標(biāo)記可通過(guò)重組酶 的表達(dá)被外重組。
[0184] 置換序列還可以是靶序列的經(jīng)修飾形式，例如以改變對(duì)感興趣的序列的調(diào)控或表 達(dá)與原始基因產(chǎn)物相比性質(zhì)改變的經(jīng)修飾的基因產(chǎn)物。
[0185] 置換序列還可以組成已存在于宿主細(xì)胞基因組中的感興趣的序列的額外拷貝，以 擴(kuò)增所述的感興趣的序列。
[0186] 置換序列可以相對(duì)于宿主細(xì)胞是同源的或異源的序列。其可以從任何合適的來(lái)源 獲得或者可通過(guò)訂制合成制備。
[0187] 靶序列可以是任何感興趣的序列。例如，靶序列可以是利用失活或修飾該序列而 被研究其功能的序列。靶序列還可以是這樣的序列，其失活、修飾或過(guò)表達(dá)是期望的以賦予 宿主細(xì)胞期望的表型。典型地，本發(fā)明所述的方法將導(dǎo)致靶位點(diǎn)的一些核酸序列被移除。然 而，本發(fā)明所述的方法可被用于在靶位點(diǎn)插入序列而不從靶位點(diǎn)丟失任何序列。
[0188] 在本公開(kāi)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"核酸"、"核酸序列"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核 酸片斷"、"分離的核酸片段"在本文中可被交換使用。
[0189] 這些術(shù)語(yǔ)包括核苷酸序列及其類似物。核酸可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA的聚 合物，任選地，其含有合成的、非天然的或改變的核苷酸堿基。
[0190] DNA聚合物形式的核酸可包括cDNA、基因組DNA或合成DNA或其混合物中的一種 或更多種區(qū)段。
[0191] 術(shù)語(yǔ)"分離的核酸"和其類似物指的是大體上不含其它核酸序列（例如但不限于 其它染色體的和染色體外的DNA和/或RNA)的核酸?？蓮姆蛛x的核酸天然存在的宿主細(xì) 胞中將其純化。
[0192] 可使用技術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法獲得分離的核酸。該術(shù)語(yǔ)還包括重組 的核酸和化學(xué)合成的核酸。典型地，可利用本領(lǐng)域已知的任何擴(kuò)增方法（例如PCR、RT-PCR 等）產(chǎn)生適用于本發(fā)明的兩種或更多種核酸中的每一種。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增"或"擴(kuò) 增反應(yīng)"指的是用于增加核酸中靶序列拷貝的任何體外方法。有時(shí)候，擴(kuò)增指的是靶核酸的 "指數(shù)"增加。然而，本文中使用的"擴(kuò)增"還可以指選擇的核酸靶序列的數(shù)目線性增加，但 典型地不同于一次、單引物延伸步驟。
[0193] 典型地，兩種或更多種核酸被引入宿主細(xì)胞以使重組事件可發(fā)生。可使用本領(lǐng)域 的技術(shù)人員公知的多種技術(shù)將所述的兩種或更多種核酸引入宿主細(xì)胞。被用于引入異源 的核酸至多種生物體的方法的非限制性實(shí)例包括：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔、超聲介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 化、粒子轟擊等。在某些情況下，加入載體分子能夠增加典型地被認(rèn)為很難通過(guò)常規(guī)方法轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞對(duì)DNA的攝取。技術(shù)人員易于得知轉(zhuǎn)化的常規(guī)方法。
[0194] 用于產(chǎn)生兩種或更多種核酸以及之后將它們引入宿主細(xì)胞的程序是本領(lǐng)域的 技術(shù)人員公知的。（參見(jiàn)，例如 Sambrook&Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed. ,CSHL Press,Cold Spring Harbor,NY,2001 ;和Ausubel et al. ,Current Protocols in Molecular Biology, Wiley InterScience, NY,1995)〇
[0195] 此外，標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)（例如DNA分離、凝膠電泳、核酸的酶促限 制性修飾、Southern分析、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化等）是技術(shù)人員已知的且被例如Sambrook et al. (1989)"Molecular Cloning:a laboratory manual"， Cold Spring Harbor Laboratories,Cold Spring Harbor,New York and Innis et al. (1990)〃PCR protocols, a guide to methods and applications〃Academic Press, San Diego 描述。
[0196] 可以按照標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板和恰當(dāng) 的寡核苷酸引物擴(kuò)增適用于本發(fā)明所述的方法的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆至恰當(dāng)?shù)?載體（如果期望）和/或通過(guò)核酸序列分析被表征。
[0197] 可實(shí)施本發(fā)明所述的方法以使兩種或更多種核酸被重組為單一核酸，之后其與靶 位點(diǎn)重組。
[0198] 可實(shí)施本發(fā)明所述的方法，其中所述的兩種或更多種核酸的相互重組以及與靶位 點(diǎn)的重組同時(shí)發(fā)生。
[0199] 在本發(fā)明所述的方法中，至少兩種核酸中的兩種可各包含編碼標(biāo)記的序列的一部 分以使它們總共包含完整的編碼標(biāo)記的序列。
[0200] 可實(shí)施本發(fā)明所述的方法以表達(dá)針對(duì)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)的重組酶，從而使位于 兩個(gè)位點(diǎn)特異性重組位點(diǎn)之間的序列被外重組。
[0201] 標(biāo)記和重組酶的表達(dá)典型地受控制序列控制，其中所述控制序列包括能夠使重組 酶在宿主細(xì)胞表達(dá)的啟動(dòng)子。也就是說(shuō)，編碼標(biāo)記和重組酶的序列典型地與啟動(dòng)子序列可 操作地連接。
[0202] 術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"或"可操作地相連"或其類似物在本文中被定義為下述構(gòu)型： 其中控制序列被放置在相對(duì)于DNA序列的編碼序列的恰當(dāng)位置以使控制序列指導(dǎo)mRNA或 多肽的產(chǎn)生。
[0203] 術(shù)語(yǔ)"控制序列"在本文中被定義為包括對(duì)在體外或宿主細(xì)胞中產(chǎn)生mRNA或多肽 而言是必須的或有益的所有組分。每個(gè)控制序列相對(duì)編碼多肽的核酸序列而言可以是天然 或外源的。這種控制序列包括但不限于引導(dǎo)子（leader)、Shine-Delgarno序列、最佳的翻 譯起始序列（如Kozak，1991，J. Biol. Chem. 266:19867-19870中所述）、聚腺苷酸化序列、 原-肽序列（pro-peptide sequence)、前-原-肽序列（pre-pro-peptide sequence)、啟 動(dòng)子、信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止子?？刂菩蛄兄辽侔▎?dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)以及翻譯起始信號(hào) 和翻譯終止信號(hào)?？舍槍?duì)控制序列的特定目的而對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。本發(fā)明中使用的優(yōu)選的優(yōu) 化控制序列是W02006/077258中描述的那些。
[0204] 術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"在本文中被定義為下述DNA序列：其與RNA聚合酶結(jié)合并且將聚合 酶引導(dǎo)至編碼生物化合物的核酸序列的正確下游轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以起始轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶有 效地催化與編碼區(qū)的合適DNA鏈互補(bǔ)的信使RNA的組裝。術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"還可被理解為包 括用于在轉(zhuǎn)錄成mRNA之后的翻譯的5'-非編碼區(qū)（啟動(dòng)子和翻譯起點(diǎn)之間）、順式作用轉(zhuǎn) 錄控制元件（如增強(qiáng)子）和能與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的其它核苷酸序列。
[0205] 因此，可通過(guò)提供位于第一核酸上的啟動(dòng)子和位于第二核酸上的編碼序列以分開(kāi) 標(biāo)記，從而使啟動(dòng)子和編碼序列通過(guò)重組被可操作地連接，即重組將產(chǎn)生有功能的編碼標(biāo) 記的序列。
[0206] 啟動(dòng)子可以是適用于顯示轉(zhuǎn)錄活性的真核或原核宿主細(xì)胞的任何適當(dāng)?shù)膯?dòng)子 序列，其包括突變的啟動(dòng)子、截短的啟動(dòng)子和雜合的啟動(dòng)子，可以從編碼相對(duì)于細(xì)胞是同源 的（天然的）或異源的（外源的）的胞外或胞內(nèi)多肽的多核苷酸中獲得啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可 以是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。通過(guò)誘導(dǎo)性啟動(dòng)子表達(dá)重組酶將允許位于位點(diǎn)特異性重組位 點(diǎn)之間的序列的外重組被控制，例如包括編碼重組酶的序列。
[0207] 啟動(dòng)子可以是組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0208] 可使用的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例是淀粉_、纖維素_、半纖維素（比如木聚糖-和/ 或木糖-誘導(dǎo)型）、銅_、油酸-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可選自下述組，該組包括但不限于從 編碼以下的多核苷酸中獲得的啟動(dòng)子：A.oryzae TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨 酸蛋白酶、A. niger中性α -淀粉酶、A. niger酸穩(wěn)定的α -淀粉酶、A. niger或A. awamori 葡糖淀粉酶（glaA)、A. niger或A. awamori木聚糖內(nèi)切酶（xlnA)或β -木糖苷酶（xlnD)、 T. reesei纖維二糖水解酶I (CBHI)、R. miehei脂肪酶、A. oryzae堿性蛋白酶、A. oryzae磷 酸丙糖異構(gòu)酶、A. nidulans乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡糖苷酶（W000/56900)、 Fusarium venenatum Dania (W000/56900)> Fusarium venenatum Quinn(W000/56900)> Fusarium oxysporum 類膜蛋白酶蛋白酶（W096/00787)、Trichoderma reeseiP-葡萄糖 苷酶、Trichoderma reesei纖維二糖水解酶I、Trichoderma reesei纖維二糖水解酶II、 Trichoderma reesei 內(nèi)切葡聚糖酶 I、Trichoderma reesei 內(nèi)切葡聚糖酶 IKTrichoderma reesei 內(nèi)切葡聚糖酶 III、Trichoderma reesei 內(nèi)切葡聚糖酶 IV、Trichoderma reesei 內(nèi)切葡聚糖酶V、Trichoderma reesei木聚糖酶I、Trichoderma reesei木聚糖酶II和 Trichoderma reeseiP-木聚苷酶，和NA2_tpi啟動(dòng)子（來(lái)自于編碼A.niger中性α-淀 粉酶和A. Oryzae磷酸丙糖異構(gòu)酶的多核苷酸的啟動(dòng)子的雜合物）及其突變的、截短的和雜 合的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的其它實(shí)例是W02006/092396和W02005/100573中描述的啟動(dòng)子，其 通過(guò)引用而被并入本文。使用啟動(dòng)子的另一實(shí)例描述于W02008/098933中。誘導(dǎo)型（異源 的）啟動(dòng)子的其它實(shí)例是醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子alcA、使用四環(huán)素-響應(yīng)啟動(dòng)子的tet系統(tǒng)、雌激 素-響應(yīng)啟動(dòng)子（Pachlinger et al. (2005)，Appl&Environmental Microbiol672_678)。
[0209] 控制序列還可以包括合適的轉(zhuǎn)錄終止子（終止子）序列，其被絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別 以終止轉(zhuǎn)錄。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3'_末端可操作地連接。在細(xì)胞中有功 能的任何終止子都可被用于本發(fā)明。
[0210] 控制序列還可以是合適的引導(dǎo)序列（引導(dǎo)子），其是對(duì)絲狀真菌細(xì)胞的翻譯很重 要的mRNA的非翻譯區(qū)。引導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序列的5'-端可操作地連接。在細(xì)胞 中有功能的任何引導(dǎo)序列都可被用于本發(fā)明。
[0211] 取決于宿主，可以從編碼A. oryzae TAKA淀粉酶、A. nidulans丙糖磷酸異構(gòu)酶以 及A. niger GlaA和植酸酶的多核苷酸中獲得合適的引導(dǎo)子。
[0212] 可以從Penicillium IPNS基因或pcbC基因、β微管蛋白基因中分離其它的控制 序列。W001/21779中引用的所有的控制序列均通過(guò)引用被并入本文。
[0213] 控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，其與核酸序列的3' -末端可操作地連接，轉(zhuǎn) 錄時(shí)，其被絲狀真菌細(xì)胞識(shí)別為將聚腺苷殘基添加至轉(zhuǎn)錄的mRNA的信號(hào)。在細(xì)胞中有功能 的任何聚腺苷酸化序列都可被用于本發(fā)明。
[0214] 如本文所述，在本發(fā)明所述的方法中，所述的兩種或更多種核酸總共包含編碼標(biāo) 記的序列以使所述的兩種或更多種核酸的重組導(dǎo)致所述的編碼標(biāo)記的序列被定位于同源 重組位點(diǎn)之間。
[0215] 兩種或更多種核酸的重組可導(dǎo)致所述編碼標(biāo)記的序列被定位于位點(diǎn)特異性重組 位點(diǎn)之間以使標(biāo)記可通過(guò)重組酶的表達(dá)而被外重組。
[0216] 可以使用任何合適的標(biāo)記并且公知這種標(biāo)記用于確定核酸是否被包括在細(xì)胞內(nèi)。 典型地，標(biāo)記（例如可選擇標(biāo)記）允許易于選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞?？蛇x擇標(biāo)記是其產(chǎn)物提供 殺蟲(chóng)劑或病毒抗性、重金屬抗性、對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等的基因。
[0217] 標(biāo)記基因的實(shí)例包括但不限于：（1)核酸區(qū)段，其編碼的產(chǎn)物提供對(duì)否則有毒的 化合物的抗性（例如抗生素）；（2)核酸區(qū)段，其編碼在受體細(xì)胞中否則缺乏的產(chǎn)物（例如 必需產(chǎn)物、tRNA基因、營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記）；（3)核酸區(qū)段，其編碼的產(chǎn)物抑制基因產(chǎn)物的活 性；(4)核酸區(qū)段，其編碼的產(chǎn)物易于被鑒定（例如表型標(biāo)記（例如抗生素抗性標(biāo)記（例如 β -內(nèi)酰胺酶））、β -半乳糖苷酶、熒光或其它有色標(biāo)記（例如綠色熒光蛋白（GFP)、黃色熒 光蛋白（YFP)、紅色熒光蛋白（RFP)和青色熒光蛋白（CFP)和細(xì)胞表面蛋白）；（5)核酸區(qū) 段，其與否則對(duì)細(xì)胞生存和/或功能有害的產(chǎn)物結(jié)合；(6)核酸區(qū)段，其否則抑制以上1-5 中所述的任何核酸區(qū)段的活性（例如反義寡核苷酸）；（7)核酸區(qū)段，其與修飾底物的產(chǎn)物 結(jié)合（例如限制性內(nèi)切酶）；(8)核酸區(qū)段，其可被用于分離或鑒定期望的分子（例如特異 性蛋白結(jié)合位點(diǎn)）；(9)核酸區(qū)段，其編碼否則可無(wú)功能的特定核苷酸序列（例如分子亞群 的PCR擴(kuò)增）；（10)核酸區(qū)段，當(dāng)其缺失時(shí)，將直接或間接授予對(duì)特定化合物的抗性或敏感 性；（11)核酸區(qū)段，其編碼在受體細(xì)胞中有毒的或?qū)⑾鄬?duì)無(wú)毒的化合物轉(zhuǎn)化為有毒的化合 物的產(chǎn)物（例如單純皰疹胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶）；（12)核酸區(qū)段，其抑制含有它