一種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種識(shí)別腸道病毒71型及柯薩奇病毒A16型VP4蛋白的單克隆抗體 及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種將EV71VP4蛋白嵌合到HBcAg病毒樣顆粒中制備而成 的融合蛋白，將其作為抗原免疫Balb/c小鼠。利用噬菌體展示抗體文庫(kù)技術(shù)篩選獲得能特 異性中和EV71VP4蛋白的單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口?。℉andfootmouthdisease，HFMD)是由不同的腸道病毒所引起的嬰 幼兒常見(jiàn)的傳染病，以發(fā)熱和手、足、口等部位出現(xiàn)皰瘆為特征，少數(shù)患兒出現(xiàn)中樞神經(jīng)系 統(tǒng)損傷、肺水腫、肺出血、循環(huán)衰竭及心臟損害，個(gè)別因嚴(yán)重并發(fā)癥致死。近幾十年來(lái)，手足 口病已在全世界多個(gè)地區(qū)爆發(fā)和流行，累及地區(qū)之廣，發(fā)病人數(shù)之多，引起人們高度重視。 2008年1月1日至2011年10月31日止，全國(guó)感染手足口病近476萬(wàn)例，造成1821名患 兒死亡。在2008年我國(guó)將手足口病列入法定報(bào)告管理的丙類(lèi)傳染病，要求在24h之內(nèi)上 報(bào)衛(wèi)生部。引起手足口病的腸道病毒分為腸道病毒71(Enter〇virUS 71，EV71)、?？刹《?(ECHO)、柯薩奇病毒（Coxsackievirus)A型與B型等，其中以EV71及CVA16型最為常見(jiàn)。通 常情況下，EV71與CVA16引起的手足口病在臨床癥狀等方面難以區(qū)別，但EV71易致無(wú)菌性 腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)性疾病，可危及生命。
[0003]腸道病毒 71 型（enterovirus71，EV71)屬于小RNA病毒科（Picornaradae)腸道 病毒屬（Enterovirus)，分子量約為2. 6XIO6D,約由7389?7408個(gè)核苷酸組成的?？滤_ 奇病毒A16型（CoxsackievirusA16，CVA16)亦屬于小RNA病毒科，病毒基因組為約7410b 的單鏈RNA。EV71與/或CVA16毒粒為二十面體形，立體對(duì)稱(chēng)，呈球形狀，是裸露的核衣殼， 直徑約為23-30nm，無(wú)包膜。
[0004] EV71與/或CVA16病毒的衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4組成，四種結(jié)構(gòu)蛋白中， VPl、VP2和VP3裸露于病毒顆粒的表面，而VP4則位于病毒顆粒衣殼的內(nèi)表面與RNA核心緊 密相連。根據(jù)病毒衣殼蛋白VPl核苷酸序列的不同，可將EV71分為A、B、C三個(gè)基因型，其 中B型分為B1-B5亞型，C型分為C1-C4亞型，不同亞型感染后臨床癥狀不完全相同。傳統(tǒng)意 義上認(rèn)為病毒的抗原決定簇基本上位于VP1-VP3上（CardosaMJ,PereraD,BrownBA，et al.Molecularepidemiologyofhumanenterovirus71strainsandrecentoutbreaksin theAsia-Pacificregion:comparativeanalysisoftheVPlandVP4genes[J].Emerg InfectDis，2003, 9 (4) :461-468.)。有研究發(fā)現(xiàn)EV71VP4序列N-末端的前20個(gè)氨基酸是 高度保守的，該段基因融合HBcAg形成的嵌合病毒樣顆粒（命名為HBcAg-VP4)有中和活性 的產(chǎn)生，并且能夠引起針對(duì)不同EV71基因型以及CVA16的交叉中和抗體反應(yīng)。
[0005] 單克隆抗體技術(shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)單抗），又被稱(chēng)為腫瘤"生物導(dǎo)彈"，是能直接導(dǎo)向腫瘤的 藥物。鼠源性單抗應(yīng)用于人類(lèi)有較強(qiáng)的免疫原性，但主要卻顯示誘發(fā)人抗鼠抗體（Human anti-mouseantibody,HAMA)反應(yīng)，另外，鼠源單抗不能有效激活人體免疫反應(yīng)，大大限 制 了其臨床應(yīng)用（DharR,KamakarS,SriamanR,etal.Efficacayofarecombinant chimericanti-hCGantibodytopreventhumancytotrophoblastfusionandblock progesteronesynthesis[J].AmJReprodImmunol, 2004, 51:358-363.)。降低或避免 HAM反應(yīng)以提高單抗療效的主要手段是利用抗體技術(shù)進(jìn)行鼠源單抗人源化改造，至今單 克隆抗體的應(yīng)用經(jīng)歷了非人源抗體、人鼠嵌合抗體、人源化抗體，最終制備全人源單克隆 抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠與噬菌體展示文庫(kù)幾個(gè)階段。迄今，噬菌體展示技術(shù)是發(fā)展最成熟，應(yīng) 用最廣泛的制備單克隆抗體的技術(shù)。菌體抗體庫(kù)（Phageantibodylibrary)技術(shù)是 由噬菌體展示技術(shù)發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)新型抗體制備技術(shù)，以噬菌體展示技術(shù)為基礎(chǔ)。噬菌 體抗體庫(kù)技術(shù)具備改良抗體的能力。能夠在未知目標(biāo)性能肽段的一級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下，通 過(guò)"突變-建庫(kù)-篩選"獲得具備該性能或性能得到改善的未知序列（MondonP，Dubreuil 0,BouayadiK,etal.Humanantibodylibrariesaracetoengineerandexplorea largerdiversity[J] ?FrontBio-SCI, 2008, 13:1117-1129)，可以通過(guò)引入突變或篩選高 親和力克隆，體外模擬體內(nèi)的抗體親和力成熟過(guò)程，提高其親和力。另外還能夠提高抗體的 表達(dá)量。
[0006] 目前，國(guó)內(nèi)EV71病毒滅活疫苗已完成了III期臨床研宄，但仍無(wú)相應(yīng)疫苗與藥物 獲準(zhǔn)上市，另外，針對(duì)引起手足口病的另一主要抗原CVA16病毒尚未研發(fā)出有效疫苗與藥 物，因此研制出既能中和EV71病毒又能中和CVA16病毒的藥物對(duì)于目前對(duì)抗手足口病具有 十分重要的意義。本發(fā)明即提供一種具有廣譜中和活性的預(yù)防與治療手足口病的單克隆抗 體潛在藥物的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種具有廣譜中和活性的預(yù)防與治療手足口病的單克 隆抗體的制備方法。
[0008] 一種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體或其片段，其特征在于：所述的單克隆抗 體或其片段的輕鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:1所示的基因序列。
[0009] 一種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體或其片段，其特征在于：所述的單克隆抗 體或其片段的重鏈可變區(qū)具有SEQIDNO:2所示的基因序列。
[0010] 進(jìn)一步，所述的單克隆抗體或其片段包括可變區(qū)和恒定區(qū)，所述恒定區(qū)的人 IgGlkappa輕鏈恒定區(qū)具有SEQIDNO:3所示的基因序列；所述恒定區(qū)的人IgGl重鏈恒定 區(qū)具有SEQIDNO:4所示的基因序列。
[0011] 進(jìn)一步，所述的單克隆抗體或其片段包括ScFv或Fab形式。
[0012] 制備所述的單克隆抗體或其片段的方法，其特征在于步驟如下：
[0013] 1)針對(duì)EV71VP4蛋白N-末端的前20個(gè)氨基酸序列融合HBc蛋白形成嵌合病毒樣 顆粒，命名為HBcAg-VP4蛋白；利用已經(jīng)獲得的HBcAg-VP4蛋白免疫6-8周齡的Balb/c小 鼠，取小鼠脾臟組織，研磨得到細(xì)胞，分離淋巴細(xì)胞，Trizol法提取mRNA ;
[0014] 2)將步驟1)提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增抗體可變區(qū)的輕鏈基因 片段八與重鏈基因片段VH，并利用重疊PCR拼接成\-Linker-VH形式的ScFv單鏈抗體基 因片段，經(jīng)SfiI和NotI雙酶切后插入到噬菌粒載體pCANTAB5E中，連接獲得重組質(zhì)粒 pCANTAB5E-ScFv，轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)細(xì)菌；
[0015] 3)將步驟2)中已轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pCANTAB5E-ScFv的TGl細(xì)菌繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，加入 M13K07輔助噬菌體，組裝并釋放能夠在噬菌體表面融合表達(dá)ScFv單鏈抗體片段的噬菌體， 即噬菌體展示文庫(kù)；利用ELISA法，得到與EV71-C4型病毒抗原蛋白結(jié)合的噬菌體展示文 庫(kù)，即陽(yáng)性噬菌體展示文庫(kù)，其表面展示了具有中和EV71病毒活性的陽(yáng)性抗體蛋白；
[0016] 4)克隆已篩選的陽(yáng)性抗體的可變區(qū)輕鏈基因片段'與重鏈基因片段Vh，克隆人 類(lèi)抗體IgG輕鏈恒定區(qū)基因片段與重鏈基因片段HCh，利用重疊PCR將陽(yáng)性抗體的'與 拼接并插入到pcDNA3.l/zeo(+)表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒pcDNA3. 1/zeo-L;將V#HCh拼接并插入到pcDNA3. 1 (+)表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.I-H;分別轉(zhuǎn)化TOPlO感 受態(tài)細(xì)菌，篩選陽(yáng)性菌并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，鑒定陽(yáng)性克??；利用用于表達(dá)完整單克 隆抗體A-M的重組質(zhì)粒pcDNA3. 1/zeo-L與pcDNA3.I-H共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，純化得到單 克隆抗體A-M;
[0017] 5)將步驟4)中純化后的抗體進(jìn)行體外中和試驗(yàn)，檢測(cè)抗體中和EV71-C4型病毒 的能力，計(jì)算獲得步驟4)中獲得的鼠源單克隆抗體A-M的中和效價(jià)，篩選得到能夠中和 EV71-C4型病毒的鼠源單克隆抗體A-M001。
[0018] -種重組質(zhì)粒，包括有SEQIDNO:1與SEQIDNO:2的基因序列。
[0019] -種表達(dá)載體，所述載體包含如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述單克隆抗體的序列，所 述載體為pcDNA3. 1/zeo-L與pcDNA3.l_H〇
[0020] 一種宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)染權(quán)利要求7所述的載體，所述的宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞或293細(xì) 胞。
[0021] 一種藥物，所述藥物含有如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述單克隆抗體。
[0022] 更具體的：具有廣譜中和活性的預(yù)防與治療手足口病的單克隆抗體的制備方法包 括如下步驟：
[0023] 1)針對(duì)EV71VP4蛋白N-末端的前20個(gè)氨基酸序列融合HBc蛋白形成嵌合病毒樣 顆粒，命名為HBcAg-VP4蛋白。利用已經(jīng)獲得的HBcAg-VP4蛋白免疫6-8周齡的Balb/c小 鼠，取小鼠脾臟組織，研磨得到細(xì)胞，分離淋巴細(xì)胞，Trizol法提取mRNA ;
[0024] 2)將步驟1)提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)擴(kuò)增抗體可變區(qū)的輕鏈基因 片段八與重鏈基因片段VH，并利用重疊PCR拼接成\-Linker-VH形式的ScFv單鏈抗體基 因片段，經(jīng)SfiI和NotI雙酶切后插入到噬菌粒載體pCANTAB5E中，連接獲得重組質(zhì)粒 pCANTAB5E-ScFv，轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)細(xì)菌；
[0025] 3)將步驟2)中已轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pCANTAB5E-ScFv的TGl細(xì)菌繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，加入 M13K07輔助噬菌體，組裝并釋放能夠在噬菌體表面融合表達(dá)ScFv單鏈抗體片段的噬菌體， 即噬菌體展示文庫(kù)。利用ELISA法，以高溫滅活崩解的EV71-C4型病毒包被培養(yǎng)板，加入噬 菌體展示文庫(kù)，經(jīng)過(guò)3輪淘洗富集篩選得到與EV71-C4型病毒抗原蛋白結(jié)合的噬菌體展示 文庫(kù)，即陽(yáng)性噬菌體展示文庫(kù)，其表面展示了具有中和EV71病毒活性的陽(yáng)性抗體蛋白；
[0026] 4)克隆已篩選的陽(yáng)性抗體的可變區(qū)輕鏈基因片段'與重鏈基因片段Vh，克隆人類(lèi) 抗體IgG輕鏈恒定區(qū)基因片段與重鏈基因片段HCH，利用重疊PCR將陽(yáng)性抗體的'與 拼接并插入到pcDNA3.l/zeo(+)表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒pcDNA3. 1/zeo-L;將V#HCh拼接并插入到pcDNA3. 1(+)表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒pcDNA