ACTGTCTCTGCAGCCTCCACCAAGG-3'
[0126] CH. FOR 5'-TGCTCTAGAGCATCATTTACCCGGGGACAGG-3'（Xba I)
[0127] 輕鏈恒定區(qū)引物
[0128] CL. BACK 5'-GTCGGTGGAGGCACCAAGGTGCAGATG-3'
[0129] CL. FOR 5'-TGCTCTAGAGCA CTAACACTCTCCCCTG-3'（XbaI)
[0130] 輕鏈恒定區(qū)基因片段約340bp左右，重鏈恒定區(qū)基因片段約1600bp左右，瓊脂糖 凝膠電泳鑒定并純化PCR擴增產(chǎn)物，結(jié)果如圖4所示，與預(yù)期結(jié)果一致。
[0131] 3、鼠源抗體可變區(qū)與人抗體恒定區(qū)的拼接
[0132] 以已擴增出的重鏈可變區(qū)與恒定區(qū)PCR產(chǎn)物s-VH和CH為模板，以VH. BACK與 CH. FOR為引物，重疊延伸PCR (SOE-PCR)擴增出全重鏈基因片段，以VL. BACK與CL. FOR為引 物，S0E-PCR，擴增出全輕鏈基因片段，利用瓊脂糖凝膠電泳純化PCR擴增產(chǎn)物。
[0133] 4、重組質(zhì)粒pcDNA3.I-H與pcDNA3. 1/zeo-L的構(gòu)建
[0134] 將上述已擴增出的抗體全重鏈基因片段與pcDNA3. 1(+)表達載體，全輕鏈基因片 段與pcDNA3. 1/zeo(+)表達載體，分別經(jīng)BamHI和XbaI雙酶切后進行連接，得到重組質(zhì)粒 pcDNA3.I-H與pcDNA3. 1/zeo-L，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細胞，進行質(zhì)粒提取，酶切并利用瓊脂糖 凝膠電泳鑒定結(jié)果，如圖5所示，與預(yù)期結(jié)果一致，送測序。
[0135] 實施例3、重組質(zhì)粒pcDNA3.I-H與pcDNA3. 1/zeo-L在293細胞中的表達與純化
[0136] 1、重組質(zhì)粒pcDNA3.I-H與pcDNA3. 1/zeo-L共轉(zhuǎn)染 293 細胞
[0137] 轉(zhuǎn)染前l(fā)d，將IXIO5個293細胞接種至6孔板中，用含10%FBS、無抗生素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞；細胞生長至90 %左右時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前Ih更換成Opti-MEM無血清培 養(yǎng)基；重組質(zhì)粒pcDNA3.I-H與pcDNA3. 1/zeo-L各2yg與250yIOpti-MEM混合，并加入 10y1脂質(zhì)體混合于250yIOpti-MEM中，靜置5min，將兩種混合液充分混合，靜置20min， 將脂質(zhì)體復(fù)合物加入細胞中，混勻，放37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)5h;將培養(yǎng)基更換為含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)基，收集轉(zhuǎn)染后第72h的上清200y1，夾心ELISA(二抗分別為HRP標(biāo)記羊抗人 IgG-Fc段多抗及HRP標(biāo)記羊抗人IgG(H+L)多抗）對上清進行檢測。
[0138] 2、ProteinA純化單克隆抗體
[0139] 取以上步驟制備的上清4 °C，12000g條件下離心15min;1. 5gProtein A-S印haroseCL-4B干粉用6-7mL三蒸水溶解，再用0? 02M，pH7. 4的磷酸鹽緩沖液（上樣 緩沖液）浸泡15min，裝入層析柱中；用10倍柱床體積的上樣緩沖液過柱，流速為lmL/min， 使流出液體的pH為7. 4 ;取上清5mL，以上樣緩沖液稀釋至50mL，0. 45ym濾膜過濾，上樣， 流速為lmL/min;純化后用10倍柱床體積的上樣緩沖液進行流洗，流速為lmL/min。隨后用 0. 02M，pH4. 0的檸檬酸緩沖液洗脫抗體，應(yīng)用AKTAexplorer100進行監(jiān)測，當(dāng)觀察到基線 開始上升，即出現(xiàn)洗脫峰時，收集洗脫液；收集洗脫液至洗脫峰回到基線后，繼續(xù)用5-10倍 柱床體積的上樣緩沖液平衡柱床，流速調(diào)至lmL/min。再用10倍柱床體積的三蒸水平衡柱 床。并利用SDS不連續(xù)丙烯酰胺凝膠電泳檢測純化結(jié)果。結(jié)果如圖6所示。
[0140] 實施例4、篩選具有廣譜中和活性的鼠源單克隆抗體
[0141] 1、EV71-C4型與EV71fcCr-TR型病毒的體外中和試驗
[0142] 稀釋融化好的EV71-C4型/EV71BrCr-TR型病毒，保證稀釋后每50 y 1液體中含有 100倍CCID50(cell culture infective dose 50%，細胞培養(yǎng)半數(shù)感染量）病毒。稀釋液 為細胞維持液，即含有2%FBS (invitrogen，Gibcoi''，產(chǎn)品目錄號：16000-044,購自于北京 茂健聯(lián)星科技有限公司）的DMEM(invitrogen，Gibc〇K，產(chǎn)品目錄號：11575-032,購自于北 京茂健聯(lián)星科技有限公司）。稀釋融化好的小鼠血清，將血清用含2% FBS的DMEM進行稀 釋，起始稀釋倍數(shù)為8倍，之后采用2倍稀釋法進行稀釋。
[0143] 96孔細胞培養(yǎng)板中加入50y1病毒液（100CCID50)和50y1抗體系列稀釋液。 混合后放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8h。病毒陽性孔中只加病毒不加血清（病毒滴度 設(shè)計為〇. 1CCID50、1CCID50、10CCID50、100CCID50四個梯度作為對照孔），抗體對照孔中 只加抗體不加病毒，陰性對照孔中病毒、抗體均不加。37°C孵育過夜后，加入RD細胞（中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研宄所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心，資源編號：3111C0001CCC000293)懸液 100y1 (8000個/孔）。使用倒置顯微鏡每天觀察細胞病變情況并記錄，以不產(chǎn)生細胞病變 的血清最高稀釋度的倒數(shù)為終點效價。當(dāng)100CCID50病毒陽性孔中出現(xiàn)完全病變時，判定 最終結(jié)果（約5?7d)。結(jié)果如圖7所示。
[0144] 根據(jù)上述方法，獲得能夠中和EV71-C4型/EV71BrCr-TR型病毒的人鼠嵌合單克隆 抗體A-MOO1。
[0145]根據(jù)Reed-Muench方法計算，A-M001抗EV71-C4型病毒的IC50約為0? 098mg/mL， A-M001抗EV71fcCr-TR型病毒的IC50約為0? 062mg/mL。
[0146] 2、CVA16病毒的體外中和試驗
[0147] 方法同實施例1。經(jīng)中和試驗判定結(jié)果，如圖8所示。根據(jù)Reed-Muench方法計 算，A-M001抗CVA16病毒的IC50約為0. 065mg/mL。根據(jù)上述方法，最終獲得具有廣譜中和 活性的人鼠嵌合單克隆抗體A-M001。
[0148] 鼠源單克隆抗體A-M001輕鏈可變區(qū)序列：
[0149]
【主權(quán)項】
1. 一種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體或其片段，其特征在于：所述的單克隆抗體 或其片段的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :1所示的基因序列。
2. -種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體或其片段，其特征在于：所述的單克隆抗體 或其片段的重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO :2所示的基因序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于：所述的單克隆抗體 或其片段包括可變區(qū)和恒定區(qū)，所述恒定區(qū)的人IgGl kappa輕鏈恒定區(qū)具有SEQ ID NO :3 所不的基因序列；所述恒定區(qū)的人IgGl重鏈恒定區(qū)具有SEQ ID NO :4所不的基因序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于： 所述的單克隆抗體或其片段包括ScFv或Fab形式。
5. -種制備如權(quán)利要求1或2或3所述的單克隆抗體或其片段的方法，其特征在于步 驟如下： 1) 針對EV71VP4蛋白N-末端的前20個氨基酸序列融合HBc蛋白形成嵌合病毒樣顆 粒，命名為HBcAg-VP4蛋白；利用已經(jīng)獲得的HBcAg-VP4蛋白免疫6-8周齡的Balb/c小鼠， 取小鼠脾臟組織，研磨得到細胞，分離淋巴細胞，Trizol法提取mRNA ; 2) 將步驟1)提取的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)擴增抗體可變區(qū)的輕鏈基因片 段八與重鏈基因片段VH，并利用重疊 PCR拼接成'-Linker-V11形式的ScFv單鏈抗體基 因片段，經(jīng)Sfi I和Not I雙酶切后插入到噬菌粒載體pCANTAB5E中，連接獲得重組質(zhì)粒 pCANTAB5E-ScFv，轉(zhuǎn)化TGl感受態(tài)細菌； 3) 將步驟2)中已轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pCANTAB5E-ScFv的TGl細菌繼續(xù)擴大培養(yǎng)，加入 M13K07輔助噬菌體，組裝并釋放能夠在噬菌體表面融合表達ScFv單鏈抗體片段的噬菌體， 即噬菌體展示文庫；利用ELISA法，得到與EV71-C4型病毒抗原蛋白結(jié)合的噬菌體展示文 庫，即陽性噬菌體展示文庫，其表面展示了具有中和EV71病毒活性的陽性抗體蛋白； 4) 克隆已篩選的陽性抗體的可變區(qū)輕鏈基因片段'與重鏈基因片段Vh，克隆人類抗體 IgG輕鏈恒定區(qū)基因片段HC^重鏈基因片段HC H，利用重疊 PCR將陽性抗體的八與HC滿 接并插入到pcDNA3. l/zeo(+)表達載體中，得到重組質(zhì)粒pcDNA3. Ι/zeo-L ;將V1^ HC1^ 接并插入到pcDNA3. 1 (+)表達載體中，得到重組質(zhì)粒pcDNA3. I-H ;分別轉(zhuǎn)化TOPlO感受態(tài) 細菌，篩選陽性菌并擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，鑒定陽性克?。焕糜糜诒磉_完整單克隆抗 體A-M的重組質(zhì)粒pcDNA3. Ι/zeo-L與pcDNA3. I-H共轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，純化得到單克隆 抗體A-M ; 5) 將步驟4)中純化后的抗體進行體外中和試驗，檢測抗體中和EV71-C4型病毒的能 力，計算獲得步驟4)中獲得的鼠源單克隆抗體A-M的中和效價，篩選得到能夠中和EV71-C4 型病毒的鼠源單克隆抗體A-MOOl。
6. -種重組質(zhì)粒，包括有SEQ ID NO :1與SEQ ID NO :2的基因序列。
7. -種表達載體，所述載體包含如權(quán)利要求1-6任一項所述單克隆抗體的序列，所述 載體為 pcDNA3. Ι/zeo-L 與 pcDNA3. 1-H。
8. -種宿主細胞，轉(zhuǎn)染權(quán)利要求7所述的載體，所述的宿主細胞為CHO細胞或293細 胞。
9. 一種藥物，所述藥物含有如權(quán)利要求1-6任一項所述單克隆抗體。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體的制備方法。一種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體或其片段，其特征在于：所述的單克隆抗體或其片段的重鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。將EV71 VP4蛋白嵌合到HBcAg病毒樣顆粒中制備而成的融合蛋白，將其作為抗原免疫Balb/c小鼠。利用噬菌體展示抗體文庫技術(shù)篩選獲得能特異性中和EV71 VP4蛋白的單克隆抗體。本發(fā)明提供一種具有廣譜中和活性的預(yù)防與治療手足口病的單克隆抗體潛在藥物的制備方法。
【IPC分類】A61K39-42, C07K16-10, A61P31-14, C12N5-10, C12N15-63
【公開號】CN104610450
【申請?zhí)枴緾N201510024575
【發(fā)明人】盛望, 張瀟, 白玉, 趙淼, 曾毅, 李澤琳, 劉偉
【申請人】北京工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2015年1月18日