一種鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于功能基因改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位 疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 2010年春季在我國華東、華南地區(qū)少數(shù)鴨群首次出現(xiàn)一種新發(fā)疾病，該病主要引 起鴨群采食量和產(chǎn)蛋大幅下降、卵巢出血、神經(jīng)癥狀等，因此初期該病又稱為鴨出血性卵巢 炎、產(chǎn)蛋下降綜合征等。隨著引起該病的病毒分離及對病原全基因的解析，目前該病又命名 為鴨坦布蘇病毒，定位于黃病毒科、黃病毒屬、蚊媒病毒的恩塔亞病毒群。
[0003] 鴨坦布蘇病毒為單股正鏈RNA病毒，基因組10990bp，其中95-10278bp為ORF區(qū) 域，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、 NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)，利用NSl基因序列建立進化樹，其與黃病毒屬恩塔亞病毒群和 乙型腦炎病毒群的同源性在63%-71%之間。該病侵染蛋鴨(紹興鴨、縉云麻鴨、山麻鴨、金定 鴨、康貝爾鴨、臺灣白改鴨等)、肉鴨(櫻桃谷鴨、北京鴨等）和野鴨種鴨。受感染鴨群里的鴨 幾乎全部發(fā)病，死亡率為5%-30%不等。
[0004] 據(jù)不完全統(tǒng)計，在蛋鴨和肉鴨主產(chǎn)區(qū)，約有1. 2億只蛋鴨和1500多萬只肉鴨發(fā)病， 累計經(jīng)濟損失超過50億元。作為新發(fā)病毒，目前尚無商業(yè)化的鴨坦布蘇病毒疫苗進行防 控。黃病毒屬中，其包膜蛋白E具有高免疫原性，并能引起強烈和持久的免疫反應(yīng)，黃病毒 屬的包膜E蛋白按其空間結(jié)構(gòu)可分為DomainI、DomainII和DomainIII三個結(jié)構(gòu)域，其 中DomainIII結(jié)構(gòu)域是病毒與細胞表面受體的結(jié)合位點。Chu等構(gòu)建了表達西尼羅病毒E 蛋白結(jié)構(gòu)域III的重組質(zhì)粒，并以腹腔注射途徑免疫BALB/C小鼠，同時輔以寡脫氧核苷酸 (CpG-DNA)作為佐劑，3周后，免疫的小鼠可產(chǎn)生高滴度的西尼羅病毒中和抗體。培養(yǎng)免疫 西尼羅病毒E蛋白DomainIII和CpG的小鼠脾細胞，發(fā)現(xiàn)可分泌大量的IFN-Y和IL-2,并 引起T細胞增殖。實驗結(jié)果表明，輔以佐劑CpG免疫西尼羅病毒E蛋白DomainIII可使小 鼠產(chǎn)生抗西尼羅病毒的Thl型免疫應(yīng)答，對預防西尼羅病毒感染起到了潛在的免疫保護作 用。
[0005] 因此E蛋白是研究最廣泛應(yīng)用的抗原蛋白，可作為黃病毒亞單位疫苗和DNA疫苗 的候選蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗，即通過生物軟件預 測分析鴨坦布蘇病毒E蛋白的主要抗原表位，通過篩選、拼接等技術(shù)獲得一個新型融合蛋 白DE，并以該蛋白作為抗原來制備鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗。
[0007] 本發(fā)明首先提供一種鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE，其編碼蛋白的氨基酸序列為 SEQIDNO:1 ; 上述蛋白的一種核苷酸序列為SEQIDNO:2 ; 本發(fā)明還提供一種鴨坦布蘇病毒基因工程重組亞單位疫苗，其中的抗原為上述的鴨坦 布蘇病毒蛋白DE，其濃度為0. 1-0. 5mg/ml之間； 本發(fā)明的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗，其制備步驟如下： 1) 將鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE基因連入表達載體中，構(gòu)建成表達重組質(zhì)粒； 2) 將構(gòu)建的表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建了能表達鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE 的重組基因工程菌；用該重組基因工程菌表達出鴨坦布蘇病毒DE蛋白； 3) 對重組表達的鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE進行純化后，加入白油佐劑制成疫苗。
[0008] 本發(fā)明利用pET28a( + )表達性載體構(gòu)建了能表達鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE 的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。經(jīng)SDS-PAGE分析，表達出了 20kD重組目的蛋白。將重組 蛋白純化后制備成基因工程亞單位疫苗，免疫14日齡櫻桃谷肉鴨，免疫后可使鴨群獲得免 疫保護。
【具體實施方式】
[0009] 下面結(jié)合【具體實施方式】來進一步描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是， 在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案的情況下可以對本發(fā)明的技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或 替換，這些修改和替換均落入本發(fā)明保護范圍內(nèi)。
[0010] 實施例1鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE基因的獲得 利用生物軟件DNAStar對鴨坦布蘇代表毒株ZJ-6 (GenBank登錄號JF459991. 1)的 包膜蛋白E進行抗原表位分析，選定E蛋白抗原性較強N端部分（61-138aa)與C端主要 DomainIII部分（322-408aa)序列進行拼接，中間設(shè)計Lingker(GGGS)進行連接，獲得一種 新型融合蛋白DE，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO: 1，并利用在線生物軟件DMWorks 進行大腸桿菌稀有密碼子優(yōu)化，獲得融合蛋白DE的核苷酸序列SEQIDN0:2。
[0011] 將新獲得的融合蛋白DE的核苷酸序列進行全基因合成，同時兩端分別加上BamH I和HindIII酶切位點。
[0012] 實施例2基因工程蛋白表達載體的構(gòu)建與工程菌的獲得 1、上述擴增得到的新型融合蛋白DE基因用BamHI和HindIII雙酶切后連入pET28a載體相應(yīng)的酶切位點，構(gòu)建pET28a/DE表達載體。
[0013] 2、用CaCl2法將pET28a/DE表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于含50iig/ ml卡那霉素的瓊脂平板，37°C過夜培養(yǎng)。選取10個單菌落提取質(zhì)粒，BamHI和HindIII 雙酶切驗證陽性的菌落進一步測序鑒定。將測序驗證后的陽性克隆在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵培 養(yǎng)至0. 6?0. 8時加入0. 8mMIPTG誘導4?5小時，離心收集菌體跑SDS-PAGE電泳，同時 設(shè)立未誘導菌體作為對照。結(jié)果誘導后陽性克隆比對照菌在20kD處多出一條蛋白條帶，與 重組蛋白理論分子量一致，表達量約為30%以上。經(jīng)鴨坦布蘇抗體免疫印跡檢定，顯示陽性 反應(yīng)。證明獲得的陽性克隆為高效表達基因工程蛋白的工程菌。
[0014] 實施例3發(fā)酵、純化與鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗的制備規(guī)程 1菌毒種 1.1制造用菌種為鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗生產(chǎn)菌株；檢測用的強毒株為 鵝源坦布蘇SD株。
[0015] 1.2生產(chǎn)用菌種標準 I. 2. 1形態(tài)和生化特性 含有卡那霉素的LB瓊脂平板上過夜培養(yǎng)，在培養(yǎng)板上呈現(xiàn)圓形、邊緣整齊、突起、乳白 色有光澤的光滑菌落，革蘭氏染色后，鏡下顯示為革蘭氏陰性短桿菌；生化試驗結(jié)果均為葡 萄糖發(fā)酵+，吲哚試驗+，甲基紅試驗+，VP_，枸櫞酸利用試驗_。
[0016] 1.2. 2培養(yǎng)特性可在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長。
[0017] 1.2.3鑒別檢驗 1. 2. 3.IPCR檢測將本菌的LB液體培養(yǎng)物3ill做模板，用以下PCR引物進行PCR擴增，應(yīng)能擴增出438bp左右的片段。
[0018]Pl:5' -CACCGAATCTCGTTGCCC-3' P2 : 5 ' -CGGATCTGACCTTTGCCA-3' 擴增的條件如下：94°C5min變性，94°C30S，55°C30S，72°Clmin，30 個循環(huán)，72°C延 伸lOmin。 1. 2. 3. 2Western-blot檢測將LB固體培養(yǎng)平板上的重組菌單菌落接種于5ml含 有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D_值在0. 6?I. 0之間時加入0. 8mM的IPTG誘 導，持續(xù)培養(yǎng)4小時，收集菌體，用PBS重懸后高壓勻質(zhì)破碎，8000r/min離心去沉淀，上清 液與抗鴨坦布蘇病毒陽性血清進行Western-blot試驗，應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶。
[0019] 1.2. 4純粹用適宜培養(yǎng)基檢查，應(yīng)純粹。
[0020] 1.2.5基礎(chǔ)種子代次F5~F8代。
[0021] 1.2.6保存凍干菌種，_20°C，保存期為2年。