r>[0022] 疫苗制造及半成品檢驗(yàn) 2. 1生產(chǎn)用種子制備 2.1.1 一級種子繁殖和鑒定將凍干菌種分別接種于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基 中，37°C振蕩培養(yǎng)8~10小時(shí)，然后劃線接種于含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng) 16~18小時(shí)，作為一級種子。在2?8°C保存，不超過14天；在培養(yǎng)基上傳代，應(yīng)不超過2代。
[0023] 2. 1.2二級種子繁殖在一級種子中選取符合1.2. 1項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落10個混 合于少量LB培養(yǎng)液中，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)8?10小時(shí)，進(jìn)行純粹 檢驗(yàn)，應(yīng)純粹。置2?8°C保存，應(yīng)不超過3天。
[0024] 2. 2制苗用培養(yǎng)基為改良LB培養(yǎng)基，每1000ml培養(yǎng)基中含胰蛋白胨10g，酵 母浸粉5g，氯化鈉10g，葡萄糖5g，MgSO4 ? 7H20 5g。
[0025] 2. 3制苗用抗原液制備 2. 3. 1 菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按培養(yǎng)罐容積裝入適量培養(yǎng)基（70%左右）及 消泡劑，滅菌后按培養(yǎng)基量的5%接種二級種子菌液，37°C通氣培養(yǎng)，待菌液的0D_值達(dá)到 7. 0時(shí)，加入8g/L的a-乳糖誘導(dǎo)，再繼續(xù)培養(yǎng)6?8小時(shí)。使用20%Na0H調(diào)節(jié)pH在7. 0， 通過轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)控制溶氧在20%以上。當(dāng)溶氧迅速上升時(shí)，流加補(bǔ)料。
[0026] 2. 3. 2破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體。收集的菌體用PBS清洗2次，將收集的 菌體用PBS制成10%的懸液，在4°C下用高壓勻漿機(jī)破碎細(xì)菌。破碎后的菌液，8000r/min， 離心15分鐘，收集上清液。
[0027] 2.3.3 鎳柱層析純化收集的重組蛋白洗脫液放入透析袋，PBS液作為透析外 液，透析脫鹽后即得重組蛋白液。
[0028] 2. 3.4 滅活將純化的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，甲醛溶液的最終 濃度為〇. 2%，37°C滅活12小時(shí)，以滅活殘存的大腸桿菌。取少量樣品進(jìn)行半成品檢驗(yàn)。2? 8°C保存，不超過7天；-15°C以下保存，不超過60天。
[0029] 2. 4半成品檢驗(yàn) 2.4. 1蛋白DE含量檢測用BCA法檢測上清液蛋白濃度，稀釋至終濃度0.5mg/ml，無 菌過濾,待用。
[0030] 2.4.2無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。
[0031] 2.4.3 內(nèi)毒素含量檢測按鱟試劑方法進(jìn)行內(nèi)毒素檢測，內(nèi)毒素含量不高于 1000EU/ml者方可用于制苗。
[0032] 2. 5疫苗制備 2.5. 1油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份。在油相罐中混合均勻，力口 熱融化至半透明狀，再加司本-80 6份，至溫度達(dá)到125~130°C時(shí)維持30分鐘，冷卻至室 溫備用。
[0033] 2. 5. 2水相制備取滅菌的吐溫-80 4份，加檢驗(yàn)合格的半成品96份，充分?jǐn)?拌至吐溫-80完全溶解。
[0034] 2. 5. 3乳化取油相3份置于高速剪切機(jī)內(nèi)，開動電機(jī)低速攪拌，同時(shí)緩緩加入 水相1份，再以3600r/min乳化40分鐘，在終止攪拌前加入1%硫柳汞溶液，終濃度達(dá)到 0. 01%。乳化后，取樣IOml加入離心管，以3000r/min離心15分鐘，管底析出水相應(yīng)不超過 0? 5ml〇
[0035] 2.5.4分裝定量分裝，密封瓶口。
[0036] 成品檢驗(yàn) 3. 1物理性狀 外觀為乳白色乳劑。
[0037]劑型為油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均應(yīng) 不擴(kuò)散。
[0038] 穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，經(jīng)3000r/min離心15分鐘，管底析出的水 相應(yīng)不超過〇. 5ml。
[0039] 黏度按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行，符合規(guī)定。
[0040] 裝量檢查按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行，符合規(guī)定。
[0041] 3.2無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行，無菌生長。
[0042] 3.3安全檢驗(yàn)取7-14日齡健康易感鴨10只，肌肉或頸部皮下注射疫苗Iml/ 只，觀察14天，不出現(xiàn)由疫苗引起的局部和全身不良反應(yīng)。
[0043] 3. 4效力檢驗(yàn) 取7-14日齡健康易感鴨20只平均分為二組，每組10只。第一組為免疫組，用本發(fā)明 制備的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗進(jìn)行頸部皮下或者肌肉注射免疫，0.5ml/只，第 二組為生理鹽水對照組，注射同等體積的無菌生理鹽水。免疫21天后各組肌肉注射鴨坦布 蘇強(qiáng)毒株SD株進(jìn)行攻毒，攻毒后5日剖檢，取脾臟進(jìn)行分離病毒。對照組應(yīng)至少8只分離 病毒陽性，試驗(yàn)組則至少7只分離陰性。
[0044]3.5甲醛、汞類防腐劑殘留量測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行，均符合規(guī)定。
[0045] 實(shí)施例4鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗免疫后的療效試驗(yàn) 將14日齡健康易感40只平均分為二組，每組20只。第一組為免疫組，用本發(fā)明制備 的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗進(jìn)行頸部皮下或者肌肉注射免疫，0. 5ml/只，第二組 為生理鹽水對照組，注射同等體積的無菌生理鹽水。免疫21天后各組肌肉注射鴨坦布蘇強(qiáng) 毒株SD株進(jìn)行攻毒，攻毒14天后統(tǒng)計(jì)攻毒保護(hù)率(發(fā)病只數(shù)占總只數(shù)的百分率)。其中發(fā) 病標(biāo)準(zhǔn)：臨床出現(xiàn)精神癥狀、剖檢脾臟腫大，并可在脾臟分離出鴨坦布蘇病毒。
[0046] 結(jié)果表明制備的鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗對鴨群的被動保護(hù)期在21 天以上，免疫后的鴨群在14天的攻毒保護(hù)率在70%以上，而生理鹽水對照組的攻毒保護(hù)率 為0%。證明本發(fā)明的疫苗對鴨群的保護(hù)率良好，具備臨床推廣價(jià)值。
[0047] 表1鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗免疫后的攻毒保護(hù)試驗(yàn)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
2. 如權(quán)利要求1所述的鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE的編碼基因，其特征在于，所述 的基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
3. -種鴨坦布蘇病毒亞單位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原為權(quán)利要求1所述 的鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE。
4. 如權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白 DE 的濃度為 0· 1-0. 5mg/ml。
5. 權(quán)利要求4所述的疫苗的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括有如下的步 驟： 1) 將新型融合蛋白DE基因連入原核表達(dá)載體中，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒； 2) 將構(gòu)建的表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建能表達(dá)鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE的 重組基因工程菌，用該重組基因工程菌表達(dá)出新型融合蛋白DE ; 3) 對重組表達(dá)的新型融合蛋白DE進(jìn)行純化后，加入白油佐劑制成疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一種鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗，即采用生物技術(shù)對鴨坦布蘇病毒E蛋白進(jìn)行抗原表位分析、拼接，獲得一種鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE，并以該融合蛋白作為抗原來制備鴨坦布蘇病毒基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明中鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE，其編碼蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；其中一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發(fā)明利用pET28a（+）表達(dá)性載體構(gòu)建了能表達(dá)鴨坦布蘇病毒新型融合蛋白DE的大腸桿菌BL21(DE3)宿主菌。將重組表達(dá)的蛋白純化后制備成基因工程亞單位疫苗，可使免疫后鴨群獲得免疫保護(hù)。
【IPC分類】A61K39-12, C12N15-70, C12N15-62, A61P31-14, C07K19-00
【公開號】CN104610455
【申請?zhí)枴緾N201410729749
【發(fā)明人】侯竹美
【申請人】青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月5日