用于檢測(cè)和鑒定腸出血性大腸桿菌的方法
【專利說(shuō)明】用于檢測(cè)和鑒定腸出血性大腸桿菌的方法
[0001] 本發(fā)明涉及對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌（STEC)的鑒定。
[0002] 產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌（STEC)是屬于超過(guò)400種大腸桿菌0:H血清型的大腸 桿菌的一個(gè)多元化群體，其中的一些引起從腹瀉至出血性腸炎（HC)和溶血性尿毒綜合征 (HUS)范圍的食源性疾病的爆發(fā)和偶發(fā)事件。根據(jù)它們的人類致病性，再后菌株也被稱為 腸出血性大腸桿菌（EHEC) (Levine 1987, Nataro and Kaper 1998)。HC 和 HUS 的許多病例 已經(jīng)被歸因于EHEC血清型0157: H7株，但現(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到STEC的其它血清型屬于EHEC群 體。
[0003] 因此，來(lái)自許多國(guó)家的累積證據(jù)表明，高達(dá)30-60%的人類STEC感染是由非0157 STEC引起的并且只有五至七種"優(yōu)先級(jí)" STEC血清型與HC和HUS的爆發(fā)和偶發(fā)事件有關(guān)。 這些包括血清型 026: [HI 1]、045: [H2]、0103: [H2]、0111: [H8]、0121: [H19]、0145: [H28]、 0157:[H7]以及它們的無(wú)運(yùn)動(dòng)性（non-motile)衍生物。此外，0104:[H4]的一株不尋常的 菌株與2011年全球范圍內(nèi)HC和HUS的最大爆發(fā)有關(guān)（Scheutz et al·，2011 ;Frank et al. , 2011 ；Struelens et al. , 2011 ；Gault et al.,2011)〇
[0004] 因此，許多司法管轄區(qū)正在考慮實(shí)施食品檢驗(yàn)計(jì)劃（food inspection program) 以保護(hù)公眾免受這些對(duì)人類具有高毒力的STEC株的侵害。作為基于風(fēng)險(xiǎn)的食品檢驗(yàn)計(jì)劃 的一部分，用于這些腸出血性大腸桿菌（EHEC)株的檢測(cè)的理性方法需要優(yōu)先級(jí)STEC的標(biāo) 志性特征的明確定義（例如血清群、血清型、毒力和其它標(biāo)記）和在食品中檢測(cè)這些致病性 STEC的有效方法。非0157EHEC的檢測(cè)尤其具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)樗鼈儧](méi)有特定特征將它們和共 享同樣生態(tài)位（niches)的大量無(wú)害共生大腸桿菌區(qū)分開。Karmali et al. (2003)提出了 血清致病型分類，作為基于疾病的嚴(yán)重性、頻率和與爆發(fā)的關(guān)聯(lián)來(lái)鑒定參與食源性疾病爆 發(fā)的最重要的0血清型的框架，但是各種STEC株之間的毒力差異的原因仍然不清楚。有可 能這種差異是由于STEC株所具有的毒力基因譜的差異，需要研宄以證實(shí)這一點(diǎn)并鑒定合 適的分子標(biāo)記。
[0005] 已有技術(shù)通過(guò)例如檢測(cè)stxl/stx2基因和定位于LEE (腸道細(xì)胞擦抹基因座，該基 因座首次鑒定于腸致病性大腸桿菌（EPEC)中）上eae基因的存在，來(lái)測(cè)定樣品中STEC污 染的存在。但是STEC致病性的遺傳基礎(chǔ)比這些基因之一或二者的存在或不存在更加復(fù)雜 得多。在復(fù)雜的樣品（例如食品、糞便、環(huán)境樣品）中可能包括菌株的混合物（例如STEC 和EPEC株的混合），stxl/2和eae基因的存在并不表示在該樣品中存在EHEC。
[0006] 然而，考慮到一些STEC株可引起人類非常嚴(yán)重的健康問(wèn)題，在食品產(chǎn)品中檢測(cè)到 STEC株就會(huì)丟棄所述產(chǎn)品，即使可能該STEC不會(huì)對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。由于缺乏對(duì)非致病 性STEC株和EHEC株的區(qū)分，這造成大量的浪費(fèi)。
[0007] 已經(jīng)提出采用除stxl/2和eae標(biāo)記外的其它遺傳標(biāo)記以選擇性檢測(cè)EHEC株并將 它們與非致病性STEC株區(qū)分開。例如，PCT WO 2011/018762介紹了一種涉及基因 stxl、 stx2、eae、nleB和espK的組合檢測(cè)以預(yù)測(cè)樣品中EHEC的存在的方法。
[0008] 但是，仍然需要可靠測(cè)試，用于區(qū)分性篩選包括非0157 EHEC的EHEC的存在，以及 特異性檢測(cè)EHEC血清型，尤其是在"排名前七位"血清型026: [Hll]、045: [H2]、0103: [H2]、 0111: [H8]、0121: [H19]、0145: [H28]、0157: [H7]中的 EHEC 血清型。
[0009] 本發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)鑒定出了與構(gòu)成人類健康嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)的幾種STEC株相關(guān) 的區(qū)分性遺傳標(biāo)記。特別地，他們已經(jīng)鑒定出了位于對(duì)人類具有高毒力的EHEC株的 CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成族的、規(guī)律 間隔的短回文重復(fù)序列）序列內(nèi)的遺傳標(biāo)記。
[0010] CRISPRs存在于許多細(xì)菌種屬（包括大腸桿菌）的基因組內(nèi)。它們由含有21至 47bp長(zhǎng)度并由相似大小的間隔序列分開的直接重復(fù)序列的串聯(lián)序列組成。間隔序列衍生自 外源核酸，如噬菌體或質(zhì)粒，并且已有假說(shuō)稱它們可以保護(hù)細(xì)菌免受隨后由同源噬菌體和 質(zhì)粒帶來(lái)的感染。
[0011] 本發(fā)明人已經(jīng)對(duì)與全球最頻繁的臨床病例有關(guān)的各種EHEC株的CRISPR基因座 進(jìn)行了測(cè)序，并且已經(jīng)鑒定出了不同的間隔序列，所述間隔序列可以用于特異性鑒定造成 人類中大部分 EHEC 感染的 EHEC 血清型 0157: [H7]、0145: [H28]、0103: [H2]、0111: [H8]、 0121: [H19]、045: [H2]、026: [Hll]、0104: [H4]以及它們的無(wú)運(yùn)動(dòng)性衍生物。
[0012] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是一種用于鑒定懷疑存在于樣品中的EHEC的血清型的 方法，其中所述方法包括檢測(cè)在所述樣品或由其分離的DNA中以下大腸桿菌CRISPR序列的 存在或不存在：
[0013] a)用于鑒定EHEC 0157: [H7]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列選自以下的序 列中：
[0014] -CRISPR 序列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2 和 SEQ ID NO: 3,其中所述 CRISPR SEQ ID NO: 1-3的一個(gè)或多個(gè)序列的存在表示EHEC 0157: [H7]的存在；和/或
[0015] -CRISPR序列SEQ ID NO: 4,其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0157: [H7]的 存在；和
[0016] b)用于鑒定EHEC 0145: [H28]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 5,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0145: [H28]的存在；和
[0017] c)用于鑒定EHEC 0111: [H8]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 6,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0111: [H8]的存在；和
[0018] d)用于鑒定EHEC 0121: [H19]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 7,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0121: [H19]的存在；和
[0019] e)用于鑒定 EHEC 0103: [H2]和 / 或 EHEC 045: [H2]的 CRISPR 序列，其中所述 CRISPR序列是序列SEQ ID N0:8,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0103: [H2] 和/或EHEC 045: [H2]的存在；和
[0020] f)用于鑒定EHEC 0104: [H4]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID N0:9,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 0104: [H4]的存在；和
[0021] g)用于鑒定EHEC 026: [H11]的CRISPR序列，其中所述CRISPR序列是序列SEQ ID NO: 10,并且其中所述CRISPR序列的存在表示EHEC 026: [H11]的存在。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案，所述方法包括采用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增所述CRISPR序 列的引物對(duì)所述樣品或由其分離的DNA進(jìn)行PCR測(cè)定，并檢查相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
[0023] 優(yōu)選地，所述PCR測(cè)定是采用引物的組合進(jìn)行的，所述引物的組合包括：
[0024] a)用于檢測(cè)EHEC 0157: [H7]的引物，其中所述引物由以下組成：
[0025] -靶向兩個(gè)CRISPR序列SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO:2的引物組，其中所述引物由 以下序列定義：
[0026] GGGAACACAAACCGAAACACA(SEQ ID NO:11)
[0027] CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID N0:12)和
[0028] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:3的引物組，其中所述引物由以下序列定義：
[0029] GAACACTTTGGTGACAGTTTTTGT(SEQ ID NO:13)；
[0030] CTTAGTGTGTTCCCCGCGC(SEQ ID NO:14),
[0031] 其中針對(duì)所述引物組至少之一的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表示EHEC 0157: [H7]的存在； 和/或：
[0032] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:4的引物組，其中所述引物由以下序列定義：
[0033] GAACACAAACCGAAACACACG(SEQ ID NO:15)
[0034] ATAAACCGTCACCAAAACAGTG(SEQ ID NO:16),
[0035] 其中針對(duì)所述引物組的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表示EHEC 0157: [H7]的存在；和
[0036] b)用于檢測(cè)EHEC 0145: [H28]的引物，其中所述引物由以下組成：
[0037] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:5的引物組，其中所述引物由以下序列定義：
[0038] GAACTTGAGCCCTGCCAGAA(SEQ ID NO:17)
[0039] ACCGCGATCTTTTCCTACCTG(SEQ ID NO:18),
[0040] 其中針對(duì)所述引物組的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表示EHEC 0145: [H28]的存在；
[0041] 和
[0042] c)用于檢測(cè)EHEC 0111: [H8]的引物，其中所述引物由以下組成：
[0043] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:6的引物組，其中所述引物由以下序列定義：
[0044] GTGACCGCCTGTACACGC(SEQ ID NO:19)
[0045] CGGATATTTGGGCGTAATACC(SEQ ID NO:20)
[0046] CTGCCGCGAGTGGTTTCAC(SEQ ID NO:21),
[0047] 其中針對(duì)引物對(duì)SEQ ID NO: 19和SEQ ID N0:20或SEQ ID NO: 19和SEQ ID N0:21 的至少之一的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在表示EHEC 0111: [H8]的存在；和
[0048] d)用于檢測(cè)EHEC 0121: [H19]的引物，其中所述引物由以下組成：
[0049] -靶向CRISPR序列SEQ ID N0:7的引物組，其中