生物改性蓖麻蛋白質(zhì)的制備方法及其在制備抗惡性胸膜間皮瘤藥品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物的制備方法及其新用途，尤其是生物改性蓖麻蛋白質(zhì)的制備 方法及其在制備抗惡性胸膜間皮瘤藥品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性胸膜間皮瘤是原發(fā)于胸膜間皮組織的一種胸膜腫瘤。大約80%的惡性胸膜間 皮瘤的患者與職業(yè)環(huán)境中接觸各種石棉纖維有關(guān)，其它導(dǎo)致惡性胸膜間皮瘤的可能因素有 結(jié)核性胸膜炎、病毒感染、放射線輻射、特殊工業(yè)化合物的接觸史以及遺傳因素等。
[0003] 目前常用的治療方法有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、免疫治療及分子靶向治 療。
[0004] 中醫(yī)則對(duì)癥狀分別以行氣活血、利水逐飲、益氣補(bǔ)陰、清熱化痰等方式治療。
[0005] CN103842823A公開(kāi)了用于胸膜間皮瘤患者的早起發(fā)現(xiàn)的分子標(biāo)志物及其表達(dá)分 析方法。該發(fā)明提供了間皮瘤的檢測(cè)方法，包括受試者的血液和胸水中的至少任一種樣品 中的人骨膜蛋白蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定方法。
[0006] CN101868249A公開(kāi)了治療間皮瘤的藥物的方法，該方法涉及使用至少一種減毒的 麻瘆病毒來(lái)制備旨在治療個(gè)體的惡性間皮瘤的藥物。
[0007] CN102159709A公開(kāi)了用于惡性間皮瘤的新型治療劑和免疫刺激劑，該發(fā)明提供了 使用REIC/DKK-3來(lái)治療惡性間皮瘤的方法和含有REIC/DKK-3的用于惡性間皮瘤的治療 劑。
[0008] CN103288968A公開(kāi)了一種抗腫瘤靶向復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用，該發(fā)明涉及一 種抗腫瘤靶向復(fù)合物，該復(fù)合物是蝎氯毒素和蛙卵核糖核酸酶通過(guò)二硫鍵交聯(lián)得到的化學(xué) 交聯(lián)復(fù)合物CTX-0nC〇
[0009] 蓖麻是大戟科蓖麻屬植物，蓖麻種子含有蓖麻毒素、血細(xì)胞凝集素等成分，蓖麻毒 素是一種蛋白質(zhì)毒素，存在于蓖麻籽的蛋白質(zhì)中。
[0010] 蓖麻毒素是由兩條多肽鏈組成，N-末端的氨基酸是異亮氨酸（lie)和丙氨酸 (Ala)，根據(jù)末端氨基酸命名為lie鏈（即A鏈）和Ala鏈（即B鏈)，兩鏈間由一個(gè)二硫鍵連 接。
[0011] 實(shí)驗(yàn)證明：以二硫鍵結(jié)合A鏈、B鏈的蓖麻毒素毒性很強(qiáng)，但是分離的A鏈、B鏈混 合在一起卻沒(méi)有毒性，故毒素的兩鏈以二硫鍵的結(jié)合對(duì)毒性是重要的，這是一個(gè)奇妙的現(xiàn) 象。
[0012] 201210316220. 6公開(kāi)了蓖麻蛋白的生物改性工藝，該發(fā)明生物改性過(guò)程首先誘導(dǎo) 昆蟲(chóng)逐漸嗜硫到一定程度后加入到含蓖麻毒素的培養(yǎng)基中，可以對(duì)蓖麻毒素A鏈與B鏈間 的雙硫鍵快速進(jìn)行切割，并與切割后的A鏈和B鏈分別產(chǎn)生抗性應(yīng)答物，既消除蓖麻毒素的 毒性，又充分利用A鏈與B鏈的生物活性制備出一種獨(dú)特蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明的目的是提供一種生物改性蓖麻蛋白質(zhì)的制備方法及其在制備抗惡性胸 膜間皮瘤藥品中的應(yīng)用，利用生物改性蓖麻蟲(chóng)體為原料，經(jīng)過(guò)分離純化蛋白質(zhì)，再用此蛋白 質(zhì)制備各種劑型的藥品，本過(guò)程工藝簡(jiǎn)要明了，藥品成分明確，一致性好，療效明顯。
[0014] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的： (1)將1000g生物改性蓖麻蟲(chóng)體在常溫膨化裝置（200520108339. X)中常溫條件下膨化 粉碎。
[0015] 本步驟中，所述膨化壓力為0?l~5MPa，時(shí)間為10~60min。
[0016] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6)中，加入 膨脹溶劑并加壓至2~10MPa，形成膨脹溶劑體系，提取出生物改性蓖麻蛋白質(zhì)粗品。
[0017] 本步驟中，所述膨脹溶劑由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH 3 ? H20組成或由l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化銨組 成。
[0018] 本步驟中，所述提取溫度為10~20°C，時(shí)間為10~30min。
[0019] (3)收集含有生物改性蓖麻蛋白質(zhì)粗品的溶液并且用微孔過(guò)濾器過(guò)濾去掉雜質(zhì)。
[0020] 本步驟中，所述微孔過(guò)濾器的孔徑為0. 5~50Mm。
[0021] (4)用超濾機(jī)超濾處理，收集含有相應(yīng)分子量的生物改性蓖麻蛋白質(zhì)超濾溶液。
[0022] 本步驟中，所述超濾機(jī)的孔徑為50~100nm。
[0023] (5)超濾液溶解在適宜的溶劑中用固相萃取柱分離，收集洗脫成分。
[0024] 本步驟中，所述溶劑為乙腈。
[0025] (6)將洗脫成分溶解在合適的溶劑體系中，用超聲駐波液相制備色譜 (200920274485. 8)分離純化。
[0026] 本步驟中，所述溶劑體系由正丁醇-乙酸乙酯-水(體積比1. 25:3. 75:5)組成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）組成。
[0027] (7)純化后的生物改性蓖麻蛋白質(zhì)用真空冷凍干燥機(jī)制備成凍干蛋白粉。
[0028] 本步驟中，所述真空冷凍干燥溫度為_(kāi)30~50°C、時(shí)間為18~26h。
[0029] (8)賦予不同的藥用輔助材料，分別制備成注射劑、口服劑、栓劑，可用于制備抗惡 性胸膜間皮瘤藥品。
[0030] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下：通過(guò)本發(fā)明分離純化的生物改性蓖麻蛋白 質(zhì)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法及葡聚糖凝膠G-75凝膠過(guò)濾法測(cè)得相對(duì)分子量為 11. 8~12. 6KPa ;用等電聚焦發(fā)測(cè)定其等電點(diǎn)為pH8. 2~9. 3 ;常規(guī)化學(xué)法分析結(jié)果表明其不 含糖類和磷酸基團(tuán)；紫外分光光度法分析在260nm和280nm測(cè)定純化的生物改性蓖麻蛋白 質(zhì)含量為98. 2%;分子結(jié)構(gòu)屬非典型、非單一的昆蟲(chóng)蛋白質(zhì)，鏈內(nèi)與鏈間不含二硫鍵，其三 級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象單元以無(wú)規(guī)卷曲為主，a螺旋與0折疊的含量比例基本相當(dāng)。本發(fā)明制備的 生物改性蓖麻蛋白質(zhì)制劑質(zhì)量穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)清楚，藥理明晰，療效明顯，含量可檢可測(cè)，劑型多 樣，成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限如此，凡是對(duì) 本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵 蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0032] 實(shí)施例1: (1) 將1000g生物改性蓖麻蟲(chóng)體干燥品裝入常溫膨化裝置（200520108339.X)中，對(duì) 膨化裝置內(nèi)充入二氧化碳?xì)怏w并加壓至〇.l~5MPa，時(shí)間10~60min，然后迅速釋放壓力至常 壓，生物改性蓖麻蟲(chóng)體被膨化成粉體； (2) 膨化粉碎后的生物改性蓖麻粉體加入到膨脹溶劑體系提取裝置（201210179076. 6) 中，加入l~10Kg液態(tài)二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 *H20,加壓至2~10MPa，形成 膨脹溶劑體系，保持溫度l〇~20°C，時(shí)間10~30min，生物改性蓖麻粉體中的蛋白質(zhì)溶解，然 后降壓至常壓，生成生物改性蓖麻蛋白粗品與甲醇-NH 3 ? H20的混合液； (3) 收集含有生物改性蓖麻蛋白粗品的溶液，用孔徑0. 5~50Mm的微孔過(guò)濾器過(guò)濾去處 固體雜質(zhì)； (4) 溶液用孔徑50~100nm的超濾機(jī)超濾處理，壓力0. 3~0. 8MPa，溫度為常溫，收集含有 相應(yīng)分子量的生物改性蓖麻蛋白超濾溶液； (5) 超濾溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化預(yù)處理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超濾溶液上柱，常溫下用10~80%的 乙腈梯度脫洗，流速l~l〇mL/min，收集相關(guān)梯度的洗脫成分； (6) 將洗脫成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶劑體系中，用超聲駐 波液相制備色譜（200920274485. 8)分離純化，超聲波功率0. 2~3. 0KW，頻率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)260~280nm ; (7) 純化后的生物改性蓖麻蛋白用真空