一種登革病毒快速分型鑒別檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種登革病毒血清型快速鑒別檢測(cè)的試劑盒，特別是設(shè)及一種利用快 速多重實(shí)時(shí)巧光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)一管反應(yīng)即可鑒別出登革病毒四種血清型的試劑盒。 本試劑盒主要包括擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、引物探針?lè)磻?yīng)液、擴(kuò)增反應(yīng)酶系、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì) 控品，W及分隔并集中包裝該些試劑瓶或管的包裝盒。由于本試劑盒能準(zhǔn)確區(qū)分登革病毒 I型、II型、III型、IV型，可廣泛應(yīng)用于登革熱臨床早期診斷、重癥病例預(yù)警、口岸檢驗(yàn)檢 疫、疫情防控、媒介控制及科學(xué)研究等多個(gè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 登革熱和登革出血熱是由登革4個(gè)血清型的登革病毒引起的急性蟲(chóng)媒傳染病，主 要通過(guò)埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，是分布最廣，發(fā)病最 多，危害較大的一種蟲(chóng)媒病毒性疾病。在臨床上，登革熱主要W高熱、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)痛為 主，可伴有皮疹、淋己腺腫和白血球減少，此類(lèi)疾病傳播迅速，可引起較大規(guī)模的流行，病死 率較低，一般將該種病型稱(chēng)為古典型登革熱。而登革出血熱是W高熱、出血、休克、和高病死 率為特征，是較為嚴(yán)重的一種臨床類(lèi)型，伴有休克綜合征傾向的稱(chēng)為登革出血熱/登革休 克綜合征。在我國(guó)，登革熱曾在海南、廣東、廣西、福建、浙江、江蘇和港澳臺(tái)等地區(qū)暴發(fā)，而 登革出血熱/登革休克綜合征在我國(guó)云南、廣東南部和臺(tái)灣也均有爆發(fā)。2013年，云南西 雙版納爆發(fā)的即為較大規(guī)模的重癥登革出血熱疫情，后經(jīng)證實(shí)病例多為登革血清型合并感 染，或輸入性和本地感染病例交叉發(fā)生，是本次疫情較W往每年流行病學(xué)特點(diǎn)出現(xiàn)不同的 主要原因。所W值得警惕的是登革熱出現(xiàn)交叉或合并感染導(dǎo)致的重癥出血熱病例有流行的 趨勢(shì)或再度爆發(fā)的可能。
[0003] 在登革熱高發(fā)期間如果被伊蚊叮咬過(guò)，或到過(guò)有登革熱流行的國(guó)家或地區(qū)旅游， 且有被伊蚊叮咬的經(jīng)歷，就有可能會(huì)患上登革熱。目前仍未有完全有效預(yù)防感染登革熱的 疫苗，且該病具有傳染快、易流行的特點(diǎn)，一旦發(fā)生，將嚴(yán)重威脅人們健康和社會(huì)安定。為了 有效防控登革熱的發(fā)生與傳播，在疾病發(fā)生早期實(shí)行快速診斷是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)。登革病 毒毒力變化與疾病的嚴(yán)重性密切相關(guān)，盡管4個(gè)血清學(xué)病毒感染均能發(fā)生重癥登革熱，但 臨床觀察及實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果表明登革病毒II型和HI型感染更容易出現(xiàn)重癥臨床表現(xiàn)。因 此，在急性期及時(shí)檢測(cè)登革病毒核酸和鑒別血清型對(duì)重癥病例的早期預(yù)警判斷，提高臨床 救治水平，降低重癥登革熱的病死率等方面具有重大意義。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)登革病毒的診斷方法，主要還是依靠血清學(xué)試驗(yàn)、病毒培養(yǎng)和常規(guī) 的PCR檢測(cè)，其中，血清學(xué)試驗(yàn)、組織培養(yǎng)。具有靈敏度低、免疫交叉反應(yīng)W及周期長(zhǎng)等缺 點(diǎn)；而常規(guī)PCR也存在容易污染的不足。多重實(shí)時(shí)巧光PCR技術(shù)是將PCR技術(shù)和多色巧光 標(biāo)記探針相結(jié)合的先進(jìn)技術(shù)，該方法具有快速、特異、靈敏、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，結(jié)合防污 染技術(shù)處理，特別適合于大規(guī)模、快速、早期診斷的需求。該技術(shù)采用多色巧光對(duì)多條種特 異性探針進(jìn)行標(biāo)記，配合多重PCR技術(shù)和快速熱啟動(dòng)Taq酶，可W在同一個(gè)PCR反應(yīng)管中 對(duì)多個(gè)病毒同時(shí)進(jìn)行快速擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)間與普通實(shí)時(shí)巧光PCR相比從100-120min可縮短 至50-60min，大大提高了檢測(cè)效率；另外各色巧光的增長(zhǎng)信號(hào)與相應(yīng)PCR產(chǎn)物的增長(zhǎng)量成 等比關(guān)系，并被自動(dòng)化巧光檢測(cè)儀收集，最后可通過(guò)分析巧光增長(zhǎng)曲線達(dá)到檢測(cè)病原體類(lèi) 型的目的。因此，將多重實(shí)時(shí)巧光PCR技術(shù)應(yīng)用于登革病毒分型的快速檢測(cè)，能夠節(jié)約時(shí) 間、減少取材數(shù)量、提高檢測(cè)鑒別效率，能在短時(shí)間內(nèi)判斷疑似病例或可疑媒介是否感染登 革病毒及同時(shí)確認(rèn)所感染血清型，便于臨床及時(shí)采取必要的防控和治療措施，尤其提高重 癥病例的治愈率，對(duì)于防止該些病毒繼續(xù)傳播，提高診療效率意義重大，檢測(cè)結(jié)果為快速診 斷、有效監(jiān)測(cè)和針對(duì)性治療提供數(shù)據(jù)支持和依據(jù)。
[0005] 本發(fā)明采用實(shí)時(shí)巧光PCR技術(shù)中的多重實(shí)時(shí)巧光PCR方法，對(duì)登革四種血清型 (登革病毒I型、II型、III型、IV型）核酸進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)記的四色巧光的擴(kuò)增情況，來(lái) 鑒別四種血清型。本發(fā)明的快速鑒別試劑盒可廣泛地運(yùn)用于由登革病毒引發(fā)的登革熱或疑 似登革熱患者的樣本檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)室診斷，尤其適用于交叉感染或混合感染的登革熱患者的 臨床樣本快速檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用多重實(shí)時(shí)巧光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行登革病 毒四種血清型的鑒別試劑盒，利用本試劑盒可W準(zhǔn)確區(qū)分登革病毒I型、II型、III型、IV 型。
[0007] 在對(duì)GENBANK上所有已知的登革病毒各血清型的核酸序列進(jìn)行比對(duì)的基礎(chǔ)上，分 別尋找各型別核酸序列的特異性保守區(qū)，并針對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)祀核巧酸引物和探針。該些引 物探針在含有耐熱DNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶、高質(zhì)量脫氧核糖核巧S磯酸（dNTPs)的RT-PCR 反應(yīng)酶系W及含有Mg"等成份的RT-PCR反應(yīng)液中，通過(guò)巧光PCR儀實(shí)現(xiàn)體外核酸的循環(huán)擴(kuò) 增。
[000引本發(fā)明所設(shè)及的試劑盒主要包括；1)擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、引物探針?lè)磻?yīng)液、擴(kuò)增反 應(yīng)酶系、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和2)分隔并集中包裝該些試劑瓶或管的包裝盒。
[0009] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是引物探針混合液由登革病毒各血清型特異性 的正、反向引物，登革病毒血清型特異性的探針組成，其特征在于登革病毒I型特異性 的正向和反向引物的序列分別是5' -TTGAGATCTCTTTTTTGAAACC-3 '（SEQ ID NO ; 1)和 5'-TCTAAGATTTCTAGCCATACCC-3' (SEQ ID N0;2);登革病毒I型特異性的探針的序列 是5'-1'〔6押〇：4口'(：1'1'(：口'6441646〇：-3,669 10側(cè)；3)，探針的兩端分別結(jié)合有巧光發(fā) 生基團(tuán)FAM和巧光澤滅基團(tuán)B冊(cè)1 ;登革病毒II型特異性的正向和反向引物的序列分別 ID NO ;5)，登革病毒II型特異性的探針的序列是5' -CATTCCTTCGTTTCCTAACAATCCCA-3' (SEQ ID NO ;6)，探針的兩端分別結(jié)合有巧光發(fā)生基團(tuán)肥X和巧光澤滅基團(tuán)Eclipse;登 革病毒III型特異性的正向和反向引物的序列分別是5' -TGTGTGATGACACGGTCACTT-3' 669 10側(cè)；7)和5'-〔八0：八0〔八61'〔八八161'(：7^八-3'669 10側(cè)；8)，登革病毒111型特 異性的探針的序列是5'-〔44416〔〇：〇：4〔47^〇：644616-3'669 10側(cè)；9)，探針的兩端 分別結(jié)合有巧光發(fā)生基團(tuán)Texas Red和巧光澤滅基團(tuán)Eclipse ;登革病毒IV型特異性的 正向和反向引物的序列分別是5' -TGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGA-3 '（SEQ ID NO ; 10)和 5'-GCAACCTCACGTCTACCTGG-3'（SEQ ID N0;11)，登革病毒IV型特異性的探針的序列是 5'-CTCGTCTCCGTTCTCCGCTCTGG-3'（SEQ ID N0;12)，探針的兩端分別結(jié)合有巧光發(fā)生基團(tuán) 切5和巧光澤滅基團(tuán)Eclipse。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是引物探針混合液中引物濃度均為〇.2mmol/l，探 針濃度均為0.1 mmol/L。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液由Tris-HCl (50mmol/L，p服.0)、 MgCla巧mmol/L)、KCl(250mmol/L)組成。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是擴(kuò)增反應(yīng)酶系由熱啟動(dòng)Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs 組成。逆轉(zhuǎn)錄酶可選擇mMLV等常用逆轉(zhuǎn)錄酶。熱啟動(dòng)Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs均可采用市 售產(chǎn)品，如Qiagen公司的產(chǎn)品，其中每人份RT-PCR反應(yīng)酶系中熱啟動(dòng)Taq酶的用量為抓， 逆轉(zhuǎn)錄酶用量為2.抓，dNTPs用量為0. 4mmol。
[001引本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是PCR擴(kuò)增的條件為；50°C 15分鐘，95°C 5分鐘； 94°C 5秒，60°C 20秒，45個(gè)循環(huán)（60°C時(shí)收集巧光信號(hào)）。
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是試劑盒提供了質(zhì)控品，分別為陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì) 控品。陰性質(zhì)控品為生理鹽水，陽(yáng)性質(zhì)控品為含有登革病毒四種血清型的滅活病毒液，由 四種登革病毒血清型陽(yáng)性核酸按照濃度為2. 0X 103copies/mL~5. 0X 107copies/mL等體 積比混合而成，優(yōu)選1.0X105copies/mレ并W等體積比混合均勻制備成陽(yáng)性質(zhì)控品。試劑 盒中進(jìn)行待檢標(biāo)本檢測(cè)可同時(shí)進(jìn)行兩種質(zhì)控品的檢測(cè)，僅當(dāng)陽(yáng)性質(zhì)控品檢測(cè)時(shí)FAM、HEX、 Texas Red及CY5通道巧光信號(hào)均呈陽(yáng)性，陰性質(zhì)控品檢測(cè)四個(gè)通道巧光信號(hào)均呈陰性時(shí)， 待檢標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果才有效。
[0015] 本發(fā)明的試劑盒擴(kuò)增待檢標(biāo)本由市售的巧光定量PCR儀自動(dòng)完成，操作簡(jiǎn)單，耗 時(shí)少，且最大限度地減少了污染的發(fā)生。檢測(cè)結(jié)果可用于登革病毒分型、輔助臨床診斷及常 規(guī)監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域研究。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點(diǎn)為；①一份樣本一次檢測(cè)即可鑒別四種血清型的感 染情況，檢測(cè)過(guò)程只需50min，相比一個(gè)樣本進(jìn)行4次檢測(cè)或只進(jìn)行登革病毒通用型巧光 法檢測(cè)，大大減少了工作量，提高了檢測(cè)效率；相對(duì)于已有的核酸雜交法檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)所 需時(shí)間縮短了一半W上；②分別針對(duì)四種血清亞型病毒核酸特異性序列設(shè)計(jì)專(zhuān)用引物、探 針，保證檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性，也具有較高通量，操作簡(jiǎn)便、相對(duì)降低成本的優(yōu)點(diǎn)，更適用 于多數(shù)患者檢測(cè)；⑨對(duì)登革病毒四種血清型核酸擴(kuò)增水平進(jìn)行檢測(cè)，可反映出樣本中登革 病毒感染的狀態(tài)及確認(rèn)是何種血清型登革病毒感染，可用于登革熱的監(jiān)測(cè)和防控及臨床診 斷，有助于登革熱的早期診斷和治療；④試劑采用滅活病毒作為陽(yáng)性質(zhì)控品，即可W對(duì)試劑 進(jìn)行質(zhì)控，也可W監(jiān)控提取過(guò)程的有效性，比質(zhì)粒作為質(zhì)控更具有效性和科學(xué)性；⑥試劑 采用擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、引物探針混合液、擴(kuò)增反應(yīng)酶系的大包裝設(shè)置，適合多種巧光檢測(cè)設(shè) 備，具有適用性更加廣泛的特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)于試劑盒溫度儲(chǔ)存條件要求大大降低，可采用低溫 4-6°C存放，有效期可達(dá)6個(gè)月。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1顯示PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件。
[00化]圖2顯示試劑盒陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中沒(méi)有S型擴(kuò)增曲線，說(shuō)明FAM、肥X、 Texas Red及CY5通道巧光信號(hào)均呈陰性。
[0019] 圖3顯示試劑盒陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中FAM通道的擴(kuò)增曲線為S型，說(shuō)明 該通道的巧光信號(hào)呈陽(yáng)性。
[0020] 圖4顯示試劑盒陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中肥X通道的擴(kuò)增曲線為S型，說(shuō)明 該通道的巧光信號(hào)呈陽(yáng)性。
[0021] 圖5顯示試劑盒陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中Texas Red通道的擴(kuò)增曲線為S型， 說(shuō)明該通道的巧光信號(hào)呈陽(yáng)性。
[002引圖6顯示試劑盒陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中CY5通道的擴(kuò)增曲線為S型，說(shuō)明 該通道的巧光信號(hào)呈陽(yáng)性。
[0023] 圖7顯示4例陽(yáng)性血清樣本的擴(kuò)增曲線。圖中4例樣本的FAM通道有明顯擴(kuò)增曲 線，說(shuō)明該樣本有登革病毒I型核酸的擴(kuò)增，表示樣本中存在登革病毒I型。
[0024] 圖8顯示1例陽(yáng)性血清樣本的擴(kuò)增曲線。圖中肥X通道有明顯擴(kuò)增曲線，說(shuō)明該 樣本有登革病毒II型核酸的擴(kuò)增，表示樣本中存在登革病毒II型。
[0025] 圖9顯示1例陽(yáng)性血清樣本的擴(kuò)增曲線。圖中Texas Red通道有明顯擴(kuò)增曲線， 說(shuō)明該樣本有登革病毒III型核酸的擴(kuò)增，表示樣本中存在登革病毒III型。
[0026] 圖10