顯示1例陽性血清樣本的擴(kuò)增曲線。圖中切5通道有明顯擴(kuò)增曲線，說明該 樣本有登革病毒IV型核酸的擴(kuò)增，表示樣本中存在登革病毒IV型。
[0027] 圖11顯示1例混合感染樣本的擴(kuò)增曲線。圖中肥X通道和Texas Red通道均有 明顯擴(kuò)增曲線，表示樣本中同時(shí)存在II型和III型核酸。
[002引 圖12顯示1例混合感染樣本的擴(kuò)增曲線。圖中FAM通道和Texas Red通道均有 明顯擴(kuò)增曲線，表示樣本中同時(shí)存在I型和III型核酸。
[0029] 圖13顯示1例混合感染樣本的擴(kuò)增曲線。圖中肥X通道和切5通道均有明顯擴(kuò) 增曲線，表示樣本中同時(shí)存在II型和IV型核酸。
[0030] 圖14顯示己型腦炎病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布巧亞病毒、漢灘病毒、漢城 病毒樣本的擴(kuò)增曲線。圖中無擴(kuò)增曲線，說明該樣本中不含有登革病毒任一血清型核酸。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，該些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0032] 實(shí)施例1登革病毒分型鑒別檢測試劑盒及其使用
[0033] 1、制備包括下列組成成分的試劑盒；引物探針混合液（50 y 1/管）1管，擴(kuò)增反應(yīng) 緩沖液（375 y 1/管），擴(kuò)增反應(yīng)酶系（75 y 1/管）1管，陽性質(zhì)控品（200 y 1/管）1管，陰性 質(zhì)控品（200 y 1/管）1管。
[0034] 2、標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸
[0035] 2. 1標(biāo)本類型；血清、血漿樣本。
[0036] 2. 2標(biāo)本采集；
[0037] 2. 2. 1血清；無菌采集發(fā)病后5天內(nèi)靜脈血3~5ml，室溫靜置30分鐘使其凝固， 然后1500~2000巧m離屯、lOmin，去除纖維蛋白和血紅球，收集血清于2ml無菌螺口塑料管 中。
[003引 2. 2. 2血漿；無菌采集血液樣本，置于含有適量抗凝劑的試管內(nèi)；緩慢搖動(dòng)試管12 次后，W 2000-300化pm離屯、lOmin (血樣采集后比之內(nèi)進(jìn)行）；將血漿置于標(biāo)記有日期、采 集時(shí)間、病歷號(hào)的試管內(nèi)，立即進(jìn)行核酸提取操作或冷藏、冷凍儲(chǔ)存。
[0039] 2. 3樣品保存和運(yùn)送
[0040] 標(biāo)本裝入螺口塑料血清管，用耐低溫油性記號(hào)筆記上編號(hào)，于-70°C W下運(yùn)輸或保 存待檢。亦可參照有關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)或有關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中推薦的方法。
[0041] 3、核酸提??；
[0042] 可采用市售的RNA提取試劑盒，建議使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的 磁珠提取試劑盒、柱提取試劑盒，并按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，最后收集到50~80 y 1 RNA溶液，直接進(jìn)行檢測或保存于-20°C。
[0043] 4、實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增及檢測
[0044] 4. 1試劑準(zhǔn)備；按比例取相應(yīng)量的引物探針混合液、擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、擴(kuò)增反應(yīng)酶 系（引物探針混合液2 y 1/人份+擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液15 y 1/人份+擴(kuò)增反應(yīng)酶系3 y 1/人 份），充分混勻后按20 y 1/管分裝成PCR反應(yīng)管，備用。
[0045] 4. 2加樣；向PCR反應(yīng)管中，分別加入提取后的陰、陽性質(zhì)控品、樣本RNA溶液 5 y 1，蓋緊管蓋，放入儀器樣品槽。
[0046] 4. 3 編輯；（ABI Prism 75〇0 巧光定量 PCR 儀）
[0047] 打開Setup窗口，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰、陽性質(zhì)控品和待測標(biāo)本，并在Name欄中設(shè) 置樣品名稱。選中所有設(shè)置樣品孔，雙擊，選擇Add Detector,選擇Repcxrter為FAM和 Quencher 為 none,再選擇 RepOTter 為肥X 和如encher 為 none ;再選擇 RepOTter 為 Texas Red和如encher為none ;然后選擇RepOTter為切5和如encher為none后關(guān)閉窗口。在 Passive Reference中選擇（none)。打開instrument窗口設(shè)置循環(huán)條件；50°C 15分鐘， 95°C 5分鐘；94°C 5秒，60°C 20秒，45個(gè)循環(huán)（見附圖1)。所有設(shè)置完成后保存文件，運(yùn) 行。
[0048] 4. 4結(jié)果分析；
[0049] 反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。在Results下打開Amp plot窗口。選擇分析的目 的樣品所在位置。將Baseline數(shù)值改為start ;3，stop ;10,并打開manual設(shè)定"T虹eshold ; 1.5 + 100000。雙擊化坐標(biāo)上數(shù)值打開Graph settings窗口，將化st Run Settings中 Log 改為 Linear，0K 后打開 Analysis preferences 窗口，在 Analysis 菜單下選擇 Analyze 自動(dòng)分析結(jié)果。
[0化0] 實(shí)施例2應(yīng)用登革病毒分型鑒別檢測試劑盒檢測臨床樣品 [0化1] 選取經(jīng)過病毒培養(yǎng)方法分別鑒定為登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III 型、登革病毒IV型陽性血清標(biāo)本各1例，W及經(jīng)病毒培養(yǎng)方法鑒定為基孔肯雅病毒、己型腦 炎病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布巧亞病毒、漢灘病毒、漢城病毒陽性的血清樣本各1例 作為特異性樣本，對(duì)所有樣本進(jìn)行核酸提取，PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析步驟參照實(shí)施例1進(jìn)行， 同時(shí)進(jìn)行陰，陽性質(zhì)控品的檢測。
[0化2] 檢測結(jié)果：陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線不呈S型（見附圖2)，陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線 為明顯S型曲線（見附圖3,4,5,6)，陰、陽性質(zhì)控品均符合試劑盒的質(zhì)控要求，因此待檢標(biāo) 本的檢測結(jié)果是有效的。由待檢標(biāo)本的檢測結(jié)果可知本試劑盒均檢測到相應(yīng)的登革病毒四 種血清型核酸的擴(kuò)增（見附圖7,8,9,10);另可檢測到混合感染的重癥登革熱病例樣本中 含有至少兩種血清型登革病毒核酸的擴(kuò)增（見附圖11、12、13)，對(duì)基孔肯雅病毒、己型腦炎 病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布巧亞病毒、漢灘病毒、漢城病毒、普馬拉病毒、黃熱病毒、 基孔肯雅熱病毒、傷寒桿菌、追原蟲無非特異擴(kuò)增（見附圖14)。
[0053] 本次試驗(yàn)中17例標(biāo)本的檢測結(jié)果與分離培養(yǎng)等鑒定結(jié)果完全吻合，說明利用本 試劑盒檢測及鑒別登革病毒血清型是可行的。本試劑盒操作簡便，檢測時(shí)間短，可實(shí)現(xiàn)高通 量檢測，加之其價(jià)格低廉，可應(yīng)用于登革熱的臨床檢測、檢驗(yàn)檢疫W及疫情監(jiān)測，對(duì)重癥登 革熱的快速檢測，提高治療效率和預(yù)后具有重大意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種登革病毒快速分型鑒別檢測試劑盒，包括：1)擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、引物探針反應(yīng) 液、擴(kuò)增反應(yīng)酶系、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、DEPC H2O和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或 管的包裝盒，其中引物探針反應(yīng)液由登革病毒四種型特異性的正、反向引物，登革病毒四種 型特異性的探針組成，其特征在于： 登革病毒I型特異性的正向和反向引物的序列分別是 5' -TTGAGATCTCTTTTTTGAAACC-3' 和 5' -TCTAAGATTTCTAGCCATACCC-3'，登革病毒 I 型特異 性探針的序列是5' -TCGCTCCATTCTTCTTGAATGAGCC-3'，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基 團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)BHQl ;該對(duì)引物探針可特異性地檢測登革病毒I型，對(duì)登革病毒II 型、III型及IV型無交叉反應(yīng)； 登革病毒II型特異性的正向和反向引物的序列分別是5'-GACGAGGACCATTAAAACTG-3' 和5' -CATCTCTTCAATATCCCTGC-3'，登革病毒II型特異性探針的序列是5' -CATTCCTTCGTTT CCTAACAATCCCA-3'，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)HEX和熒光淬滅基團(tuán)BHQl ;該對(duì) 引物探針可特異性地檢測登革病毒II型，對(duì)登革病毒I型、III型及IV型無交叉反應(yīng)； 登革病毒III型特異性的正向和反向引物的序列分別是 5' -TGTGTGATGACACGGTCACTT-3' 和 5' -CACCAGCAGTCAATGTCTTCA-3'，登革病毒 III 型特異 性探針的序列是5' -CAAATGCCCCCACATTACCGAAGTG-3'，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基 團(tuán)Texas Red和熒光淬滅基團(tuán)Eclipse ;該對(duì)引物探針可特異性地檢測登革病毒III型，對(duì) 登革病毒I型、II型及IV型無交叉反應(yīng)； 登革病毒IV型特異性的正向和反向引物的序列分別是 5' -TGAATGTGGTGTTAAAGCTACTGA-3' 和 5' -GCAACCTCACGTCTACCTGG-3'，登革病毒 IV 型特異 性探針的序列是5' -CTCGTCTCCGTTCTCCGCTCTGG-3'，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán) Cy5和熒光淬滅基團(tuán)Eclipse ;該對(duì)引物探針可特異性地檢測登革病毒IV型，對(duì)登革病毒I 型、II型及III型無交叉反應(yīng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于所用探針5 '端可采用FAM、VIC、 YELLOW、TAMRA、NED、JOE、Texas Red、Cy5、Cy3 中任一種熒光基團(tuán)標(biāo)記；3 '端可采用 TAMRA、 BHQ1、BHQ2、Eclipse中任一焚光淬滅基團(tuán)標(biāo)記。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于引物探針混合液中引物濃度均為 0. 2mmol/L，探針濃度均為 0. lmmol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液由pH值為8. 0~8. 8 的 50mmol/L Tris-HCl、3 ~8mmol/L MgCl2、150 ~350mmol/L KCl 組成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中擴(kuò)增反應(yīng)酶系由Fast-Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs 組成，特征在于每人份擴(kuò)增反應(yīng)酶系中Fast-Taq酶的用量為3~8U，最佳用量5U ;逆轉(zhuǎn)錄 酶用量為1. 5~5U，最佳用量2. 5U ;dNTPs為0. 2~0. 4mmol，最佳用量為0. 4mmol。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于PCR擴(kuò)增的條件為：50°C 15分鐘，95°C 5分 鐘；94°C 5秒，60°C 20秒，45個(gè)循環(huán)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，還提供了陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，其特征在于陰性質(zhì) 控品為生理鹽水，陽性質(zhì)控品為含有登革病毒四種血清型的滅活病毒液，由四種病毒液按 照濃度為1.0 X 105copies/mL濃度等體積比混合而成。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種登革病毒快速分型鑒別檢測的試劑盒，特別是涉及一種利用多重實(shí)時(shí)熒光快速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)鑒別登革病毒四種血清型即I型、II型、III型、IV型的檢測試劑盒。本試劑盒主要包括擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液、引物探針反應(yīng)液、擴(kuò)增反應(yīng)酶系、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品，以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。由于本試劑盒通過多種熒光通道分別檢測的方式，應(yīng)用具有快速聚合反應(yīng)的Taq酶，采用一步法實(shí)時(shí)熒光快速PCR反應(yīng)模式，能準(zhǔn)確快速檢測出樣本中是否含有登革病毒核酸并鑒別出登革病毒的四種血清型，可廣泛應(yīng)用于登革熱尤其是重癥登革熱以及混合感染登革病毒的早期鑒別診斷、疫情防控、檢驗(yàn)檢疫等多個(gè)領(lǐng)域。
【IPC分類】C12Q1-70, C12Q1-68, C12R1-93
【公開號(hào)】CN104630388
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510078267
【發(fā)明人】張復(fù)春, 高秀潔, 周其偉, 李麗梅
【申請(qǐng)人】廣州市第八人民醫(yī)院, 中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日