一種新的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)陽(yáng)性抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及寄生蟲(chóng)病診斷領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種可用于診斷細(xì)粒棘球絳 蟲(chóng)（或細(xì)粒棘球蝴）的新抗原。
[0002] 相關(guān)資助
[0003] 本發(fā)明受到以下基金的資助：國(guó)家自然科學(xué)基金（81201315);中國(guó)博士后基金 (2014M551331);國(guó)家重大科技專(zhuān)項(xiàng)（2009ZX10004-302);中國(guó)疾病預(yù)防控制中心青年基金 (2013A103);上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題（20124174)。
【背景技術(shù)】
[0004] 細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（Echinococcusgranulosus)的幼蟲(chóng)（棘球蝴）寄生于人體所引起 的細(xì)粒棘球蝴?。–ystechinococcosis)，也叫囊型包蟲(chóng)病（Cystichydatiddisease)， 是一種嚴(yán)重危害人體健康和生命安全、影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人獸共患病，是世界棘球蝴病 的主要疾病負(fù)擔(dān)，也是我國(guó)重點(diǎn)防治的寄生蟲(chóng)病之一。該病呈全球性分布，具不完全報(bào)道， 全球至少100個(gè)國(guó)家存在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的流行。高度流行區(qū)主要在歐亞大陸，非洲的北 部和東部，澳大利亞及南美洲。我國(guó)是世界細(xì)粒棘球蝴病的高發(fā)區(qū)，預(yù)計(jì)我國(guó)該病的疾病 負(fù)擔(dān)占據(jù)全球的40%。2004年全國(guó)人體重要寄生蟲(chóng)病調(diào)查表明，棘球蝴病的人均患病率 1. 08%，據(jù)估算我國(guó)有60~130萬(wàn)棘球蝴病人，受威脅人口約6600萬(wàn)，27個(gè)省、自治區(qū)、直 轄市有病例報(bào)道，98%是細(xì)粒棘球蝴病例，每年細(xì)粒棘球蝴病手術(shù)病例約2000例。
[0005] 目前對(duì)棘球蝴病的診斷主要以患者自述癥狀、醫(yī)生局部體檢為依據(jù)。由于細(xì)粒棘 球蝴呈封閉性寄生于人體的內(nèi)部臟器，傳統(tǒng)的病原學(xué)方法無(wú)法診斷，須輔以物理和其他實(shí) 驗(yàn)方法。
[0006] 現(xiàn)行診斷主要以醫(yī)學(xué)影像法為判斷標(biāo)準(zhǔn)。B超診斷是目前棘球蝴病診斷與流行病 調(diào)查的主要方法，但采用B超進(jìn)行疾病篩查仍存在問(wèn)題。例如，對(duì)檢驗(yàn)人員技術(shù)水平及經(jīng)驗(yàn) 要求高，極易與肝癌、肝血管瘤及肝囊腫混淆，且很難對(duì)2厘米以?xún)?nèi)的包囊進(jìn)行準(zhǔn)確診斷。
[0007] 免疫學(xué)檢測(cè)是人體棘球蝴病重要的輔助診斷方法。當(dāng)包囊的影像學(xué)形態(tài)不典型 時(shí)，免疫診斷具有鑒別診斷的意義；免疫學(xué)檢測(cè)的敏感性和特異性對(duì)患者的及時(shí)發(fā)現(xiàn)與治 療后隨訪(fǎng)也起到了重要作用；對(duì)流行區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查、防治規(guī)劃的制定及防治效果的考 核免疫學(xué)診斷更具有重要的參考價(jià)值。棘球蝴病血清學(xué)診斷有著長(zhǎng)久的發(fā)展史，幾乎所有 已經(jīng)出現(xiàn)的免疫學(xué)診斷方法都被用于人體棘球蝴病診斷。然而，至今沒(méi)有一種可行的診斷 工具、試劑盒或方法可以普遍應(yīng)用到棘球蝴病臨床實(shí)踐中。提高人體棘球蝴病血清學(xué)診斷 試劑的檢測(cè)效能是我國(guó)棘球蝴病防治中亟待解決的問(wèn)題。
[0008] 由于循環(huán)抗原檢測(cè)的低敏感性，抗體檢測(cè)仍然是棘球蝴病臨床診斷和流行病普查 中使用最廣泛的方法?？贵w檢測(cè)的敏感性和特異性與實(shí)驗(yàn)中所用的抗原密切相關(guān)。細(xì)粒棘 球蝴病的抗原可來(lái)源于囊液、原頭蝴、囊壁。其中囊液抗原（HCF)研宄的最多，是目前最主 要的診斷抗原來(lái)源。囊液成分復(fù)雜，有蟲(chóng)體分泌物及蟲(chóng)體表面脫落的物質(zhì)，具有很強(qiáng)的抗原 性。但不同宿主及同一宿主的不同寄生部位，囊液的抗原性相差很大，據(jù)報(bào)道其敏感性可達(dá) 75%~95%，但其特異性不高，且常與其他絳蟲(chóng)、線(xiàn)蟲(chóng)和吸蟲(chóng)有交叉反應(yīng)。此外，天然來(lái)源 的粗囊液成分復(fù)雜性，不宜于進(jìn)行質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化，產(chǎn)量低，是目前細(xì)粒棘球蝴病血清學(xué) 診斷試劑效能低，產(chǎn)品不能標(biāo)準(zhǔn)化的重要原因。
[0009] 分析粗抗原組分，采用基因工程的方法制備重組抗原替代天然抗原，是解決上述 問(wèn)題，提高細(xì)粒棘球蝴病診斷試劑效能的一種重要途徑?？乖瑽(AgB)是細(xì)粒棘球蝴包囊液 中含量最豐富的組分之一，其亞單位EgAgBl和EgAgB2的重組蛋白是目前公認(rèn)的最有前景 的細(xì)粒棘球蝴病診斷抗原。目前報(bào)道的天然抗原B對(duì)囊型包蟲(chóng)病診斷有一定的敏感性和特 異性，但往往敏感性較低，但AgB為基礎(chǔ)制備的多肽抗原如P176、P175、P177等雖然可以提 高診斷的特異性，但靈敏性往往降低。
[0010] 除此之外，也陸續(xù)有新的診斷抗原被發(fā)現(xiàn)，但到目前為止，這些已經(jīng)報(bào)道的抗原對(duì) 細(xì)粒棘球蝴病檢測(cè)的靈敏度和特異性在實(shí)際診斷中仍在很大局限性，無(wú)法滿(mǎn)足實(shí)際診斷的 要求。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種可有效提高細(xì)粒棘球蝴病診斷的靈敏度和特異性的 抗原。細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)LDH作為一種新的有效進(jìn)行細(xì)粒棘球蝴病診斷的抗原尚未有報(bào)道。
[0011] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種可有效提高細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的診斷靈敏度和特異性 的抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的就是提供一種可有效提高細(xì)粒棘球蝴病的診斷靈敏度和特異性的 抗原，及其制法和應(yīng)用。
[0013] 在本發(fā)明第一方面，提供了一種細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)乳酸脫氫酶（Echinococcus granulosuslactatedehydrogenase，EgLDH)或其基因、或其檢測(cè)試劑的用途，它們被（i) 用于制備細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（或細(xì)粒棘球蝴）的陽(yáng)性抗原；和/或（ii)用于制備診斷細(xì)粒棘球 絳蟲(chóng)（或細(xì)粒棘球蝴）的試劑或試劑盒。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)乳酸脫氫酶EgLDH選自下組：
[0015] (a)如SEQIDNO.: 1 所示的多肽；
[0016] (b)將SEQIDNO: 1氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基取代、缺失或添加而形 成的具有免疫原性的衍生多肽；
[0017] (c)與SEQIDNO:1所示氨基酸序列的同源性彡90%，較佳地彡95%的具有免疫 原性的多肽；或
[0018] (d)具有免疫原性的多肽（a)-(c)的片段。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原組合中的抗原針對(duì)的抗體不相同。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的EgLDH基因的GenBank登陸號(hào)為HM748917. 1
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的EgLDH基因的核苷酸序列如SEQIDNO. : 2所示。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽保留了SEQIDNO. :1所示多肽至少80%、90%、 95%以上的免疫原性。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽由SEQIDNO. : 1所示多肽經(jīng)1-50個(gè)，較佳地 1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)氨基酸取代、缺失或添加而形成，且所述的衍生多肽 具有免疫原性。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)試劑包括細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)乳酸脫氫酶的抗體、檢測(cè)細(xì) 粒棘球絳蟲(chóng)乳酸脫氫酶編碼序列的探針、或其組合。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒含有一容器，所述的容器內(nèi)含有EgLDH或與EgLDH 特異性結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述容器內(nèi)含有與EgLDH特異性結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物作為 陽(yáng)性對(duì)照。
[0027] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗體，所述的抗體能與SEQ ID NO. :1所示的多 肽特異性結(jié)合。
[0028] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種抗原-抗體復(fù)合物，所述的復(fù)合物包括：
[0029] ⑴SEQ ID NO.:1所示的多肽；
[0030] (ii)與（i)中的多肽特異性結(jié)合的抗體。
[0031] 在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第三方面所述抗原-抗體復(fù)合物的用途，它 被用于：
[0032] (a)制備檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（或細(xì)粒棘球蝴）的試劑或試劑盒；和
[0033] (b)用作檢測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（或細(xì)粒棘球蝴）的陽(yáng)性對(duì)照。
[0034] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)（或細(xì)粒棘球蝴）檢測(cè)試劑盒，其 特征在于，所述的試劑盒含有一容器，所述的容器中含有細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)乳酸脫氫酶或其基 因。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括酶結(jié)合液、反應(yīng)底物和任選的說(shuō)明書(shū)，較佳 地，所述的試劑盒還可包括選自下組的組分：反應(yīng)終止液、樣本稀釋液、和洗滌液。
[0036] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種診斷或非診斷性的檢測(cè)樣本中是否感染細(xì)粒棘 球絳蟲(chóng)（或細(xì)粒棘球蝴）的方法，包括步驟：
[0037](1)制備SEQ ID NO.:1所示的細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)乳酸脫氫酶作為抗原；
[0038] (2)將步驟⑴中得到的抗原與待檢測(cè)樣本接觸；
[0039] (3)檢測(cè)樣本中是否含有本發(fā)明第三方面所述的抗原-抗體復(fù)合物；
[0040] 其中，若步驟（3)中的樣本出現(xiàn)所述的抗原-抗體復(fù)合物，則表明所述的樣本感染 了細(xì)粒棘球蝴絳蟲(chóng)（或細(xì)粒棘球蝴）。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣本包括血液樣本（包括全血，血清，血漿樣本）、組織 液樣本、尿液樣本、唾液樣本、糞便樣本。
[0042] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0043] 圖1顯示了EgLDH基因PCR擴(kuò)增結(jié)果。圖中各泳道如下：M:分子量標(biāo)準(zhǔn)，1 :