嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多 核苷酸可雜交的多核苷酸。
[0067] 本發(fā)明的核苷酸序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法 獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來 設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為 模板，擴增而得有關(guān)序列。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序 列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離 得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通 常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段?？梢酝耆ㄟ^化學(xué)合 成來得到編碼本發(fā)明抗原（或其片段，或其衍生物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引 入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或如載體）和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成 將突變引入本發(fā)明抗原序列中。
[0068]應(yīng)用PCR技術(shù)擴增DNA/RNA的方法（Saiki,etal.Science1985 ;230 : 1350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的 序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。
[0069] 抗原制備方法
[0070] 本發(fā)明抗原的制備方法有以下步驟：
[0071] (1).用編碼本發(fā)明陽性抗原的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸的重 組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0072] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0073] (3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化本發(fā)明抗原。
[0074] 本發(fā)明中，多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方 法能用于構(gòu)建含抗原編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。包含上述適 當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其 能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0075] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì) 菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或 Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常 規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期 后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果 需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷 酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0076] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明抗原蛋白。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞， 培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng) 宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)）誘導(dǎo)選擇的 啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
[0077] 抗原蛋白可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其 物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化抗原蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技 術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理 (鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、吸附層析、離子交 換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
[0078] 試劑盒
[0079] 本發(fā)明還提供了一種檢測細(xì)粒棘球絳蟲的試劑盒。一般地，本發(fā)明的試劑盒包括 以下組分：容器或載體；以及位于所述容器內(nèi)或載體上的EgLDH蛋白、基因或其檢測試劑。 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括酶結(jié)合液、反應(yīng)底物和任選的說明書。較佳地，所述的 試劑盒還可包括選自下組的組分：反應(yīng)終止液、樣本稀釋液、和洗滌液。一種優(yōu)選的可用于 檢測細(xì)粒棘球絳蟲的試劑盒包括：容器以及位于容器內(nèi)的包被液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的 鼠（或羊）抗人IgG(H+L)抗體、底物液TMB、稀濃硫酸反應(yīng)終止液和樣本稀釋液。更佳地， 還含有空白對照、陽性和陰性對照和作以監(jiān)控檢測過程是否符合標(biāo)準(zhǔn)。
[0080] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0081] 1.抗原靈敏度高，不受檢測樣本感染度的影響，敏感度較高。
[0082] 2.高特異性，本發(fā)明的抗原檢測待測樣本，其假陽率極低。
[0083] 3.操作簡便，抗原可以使用通用的ELISA法讀取熒光強度值。
[0084] 4.結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性高。
[0085]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克隆：實驗室指南（NewYork:ColdSpringHarborLaboratory Press)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和分?jǐn)?shù)按 重量計算。
[0086] 通用方法和材料
[0087] 主要試劑：
[0088]
【主權(quán)項】
1. 一種細(xì)粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶（Echinococcus granulosus lactate dehydrogenase，EgLDH)或其基因、或其檢測試劑的用途，其特征在于，（i)用于制備細(xì)粒棘 球絳蟲（或細(xì)粒棘球蝴）的陽性抗原；和/或（ii)用于制備診斷細(xì)粒棘球絳蟲（或細(xì)粒棘 球蝴）的試劑或試劑盒。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的細(xì)粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶EgLDH選自 下組： (a) 如SEQ ID NO. : 1所示的多肽； (b) 將SEQ ID NO: 1氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形成的 具有免疫原性的衍生多肽； (c) 與SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的同源性彡90%，較佳地彡95%的具有免疫原性 的多肽；或 (d) 具有免疫原性的多肽（a)-(c)的片段。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的EgLDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. : 2所示。
4. 一種抗體，其特征在于，所述的抗體能與SEQ ID NO. :1所示的多肽特異性結(jié)合。
5. -種抗原-抗體復(fù)合物，其特征在于，所述的復(fù)合物包括： (i) SEQ ID NO. :1所示的多肽； (ii) 與（i)中的多肽特異性結(jié)合的抗體。
6. 權(quán)利要求5所述抗原-抗體復(fù)合物的用途，其特征在于，用于： (a) 制備檢測細(xì)粒棘球絳蟲（或細(xì)粒棘球蝴）的試劑或試劑盒；和 (b) 用作檢測細(xì)粒棘球絳蟲（或細(xì)粒棘球蝴）的陽性對照。
7. -種細(xì)粒棘球絳蟲（或細(xì)粒棘球蝴）檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有一 容器，所述的容器中含有細(xì)粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶或其基因。
8. 如權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括酶結(jié)合液、反應(yīng)底 物和任選的說明書，較佳地，所述的試劑盒還可包括選自下組的組分：反應(yīng)終止液、樣本稀 釋液、和洗滌液。
9. 一種診斷或非診斷性的檢測樣本中是否感染細(xì)粒棘球絳蟲（或細(xì)粒棘球蝴）的方 法，其特征在于，包括步驟： (1) 制備SEQ ID NO. :1所示的細(xì)粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶作為抗原； (2) 將步驟（1)中得到的抗原與待檢測樣本接觸； (3) 檢測樣本中是否含有權(quán)利要求5所述的抗原-抗體復(fù)合物； 其中，若步驟（3)中的樣本出現(xiàn)所述的抗原-抗體復(fù)合物，則表明所述的樣本感染了細(xì) 粒棘球蝴絳蟲（或細(xì)粒棘球蝴）。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，所述的樣本包括血液樣本（包括全血，血清，血漿樣 本）、組織液樣本、尿液樣本、唾液樣本、糞便樣本。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新的細(xì)粒棘球絳蟲陽性抗原及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明提供了細(xì)粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶(Echinococcus granulosus lactate dehydrogenase，EgLDH)或其基因、或其檢測試劑的用途，它們被(i)用于制備細(xì)粒棘球絳蟲(或細(xì)粒棘球蚴)的陽性抗原；和/或(ii)用于制備診斷細(xì)粒棘球絳蟲(或細(xì)粒棘球蚴)的試劑或試劑盒。本發(fā)明的該抗原對細(xì)粒棘球絳蟲的診斷敏感性和特異性均非常高，診斷效能遠(yuǎn)高于其他常規(guī)的細(xì)粒棘球絳蟲抗原。
【IPC分類】G01N33-53, C07K16-40, C12N9-04, C12Q1-68, C07K19-00, C12N15-53
【公開號】CN104651328
【申請?zhí)枴緾N201410848967
【發(fā)明人】張颋, 胡薇, 陳英, 賈利芳, 馮正, 陳軍虎, 劉杰, 奧·烏力吉, 徐斌, 莫筱瑾
【申請人】中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所, 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院, 內(nèi)蒙古民族大學(xué)
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年12月31日