藍(lán)色鏈霉菌海藻糖合酶PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物；帶有嗜熱細(xì)菌海藻糖合酶C端片段的海棲熱袍菌海藻糖合酶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0085] 圖7為四種來源的重組海藻糖合酶的SDS-PAGE電泳分析；M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量； L1-L2 :重組惡臭假單胞菌來源海藻糖合酶；L3 :重組谷氨酸棒桿菌來源海藻糖合酶；L4 :重 組天藍(lán)色鏈霉菌來源海藻糖合酶；L5:重組海棲熱袍菌來源海藻糖合酶。
[0086]圖8為惡臭假單胞菌、谷氨酸棒桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌和海棲熱袍菌來源的海藻糖 合酶酶活和與嗜熱細(xì)菌海藻糖合酶C端片段融合表達(dá)后的海藻糖合酶酶活比較。
【具體實(shí)施方式】
[0087] 通過以下的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)解釋及闡述。
[0088] 實(shí)施例1惡臭假單胞菌、谷氨酸棒桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌和海棲熱袍菌來源的海藻 糖合酶基因編碼區(qū)的克隆及在大腸桿菌中的融合表達(dá)
[0089] 1、引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)
[0090] 惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida)NBRC14164,谷氨酸棒桿菌 (Corynebacteriumglutamicum)ATCC13032,天藍(lán)色鏈霉菌（Streptomycescoelicolor) ATCC23899、海棲熱袍菌（Thermotogamaritime)MSB8 和嗜熱細(xì)菌（Thermus therm〇philuS)HB27基因組由美國喬治亞大學(xué)閆亞軍老師提供，這些菌株可購置于中國普 通微生物菌種保藏中心。
[0091] 根據(jù)已知的惡臭假單胞菌、谷氨酸棒桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌和海棲熱袍菌四種來源 的海藻糖合酶基因編碼區(qū)序列，分別設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物，設(shè)計(jì)的引物為：
[0092] 惡臭假單胞菌來源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22treSBamHF:5'-GGGAAA匹 ATCCGGCCAAGCGTTCCCGCC-3'(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn)），
[0093]下游引物 22treSXhoR: 5' -GGGAAACTCGAGTGACTCTCCCCAGGTACTGATC-3' (下劃線為 Xhol酶切位點(diǎn)）；
[0094] 谷氨酸棒桿菌來源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22cgtreSNC〇F :5' -GGGAAA CCATGGGCACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCA-3'(下劃線為Ncol酶切位點(diǎn)），
[0095]下游引物：22cgtreSHindR :5：-GGGAAAAAGCTTTTCCATATCGTCCTTTTCATCGGC~3'(下 劃線為Hindlll酶切位點(diǎn)）；
[0096] 天藍(lán)色鏈霉菌來源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22sCtreSBamHF :5' -GGGAA AGGATCCGCACCGTCAACGAGCCCGTAC-3'(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn)），
[0097]下游引物22sctreSHindR :5' -GGGAAAAAGCTTAGCGCGGCGGCCG-3'(下劃線為 HindllI酶切位點(diǎn)）；
[0098] 海棲熱袍菌來源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22tmtreSEC〇RF :5' -GGGAAAS AATTCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGC-3?(下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn)），
[0099]下游引物22tmtreSSalR :5' -GGGAAAGTCGACCCTCAACAGATCTAAGAAGAGTTTCAGATAGT T-3'（下劃線為BamHI酶切位點(diǎn)）；
[0100] PCR反應(yīng)體系為50 y L :基因組模板DNA 1 y L，上下游引物各2 y L，dNTP Mix 3 yL，2XPrimeSTAR GC Buffering 25 yL，DMS0 0.75 yL，ddH20 15.65 yL， PrimeSTARO. 6 y L〇
[0101] PCR反應(yīng)條件為98°C預(yù)變性lmin，進(jìn)行98°C 12s，65°C 10s，72°C x s，共9個(gè)循環(huán)， 然后進(jìn)行98°C 12s，56°C 30s，72°C x s，共21個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸3min，x根據(jù)片段長度 設(shè)定lmin延伸lOOObp。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖（lg/100mL)電泳，結(jié)果表 明，在正確位置上有一特異性條帶（圖1-圖4)。
[0102] 2、PCR產(chǎn)物回收及純化
[0103] 米用OMEGA公司MicroElute Gel Extraction Kit柱式DNA膠回收試劑盒回收 PCR產(chǎn)物，具體操作步驟為：
[0104] 按照步驟1所述，制備100 y LPCR反應(yīng)液，電泳后切膠，步驟如下：
[0105]a、PCR產(chǎn)物經(jīng)1% (lg/100mL)瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外燈光下用刀片切 下目的基因條帶，再將切下的膠置于1.5mL離心管中，稱量其重量，加入等重量的Binding Buffer，放于65°C水浴中至膠完全溶化。
[0106] b、將膠溶液全部移至吸附柱中，靜置10min，12000rpm離心lmin
[0107]c、將離心下來的收集管中液體再次移至吸附柱中，靜置5min，12000rpm離心 lmin，倒掉收集管中液體。
[0108] d、向吸附柱中加入700 y L SPW Wash Buffer，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中 液體，將吸附柱放入同一收集管中，重復(fù)此步驟一次。
[0109] e、將空吸附柱于12000rpm離心3min，室溫瞭干15min。
[0110] f、向空吸附柱中加入30 y L超純水，室溫靜置5min，12000rpm離心3min。
[0111] g、離心管中的溶液即為回收的DNA片段的水溶液。
[0112] h、取3yL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在正確的位置有明顯條帶，剩余DNA樣品 于-20 °C貯存。
[0113] 3、pET-22b質(zhì)粒小量提取
[0114] 采用OMEGA公司Plamid Mini kit I試劑盒小量提取質(zhì)粒，具體操作步驟為：
[0115] 將實(shí)驗(yàn)室保存的含有pET_22b質(zhì)粒的大腸桿菌DH5 a接種到到4mL含有氨芐青霉 素（100yg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16h左右。取出菌液加到2mL離心管中，常 溫，12000rpm離心lmin，棄盡上清。加入250yL溶液I，吹打混勻。加入250yL溶液II，上 下輕輕顛倒數(shù)次，混勻，常溫靜置2min。加入350yL溶液III，上下輕輕顛倒數(shù)次，使裂解 物分散均勻，常溫靜置2min，常溫12000rpm離心lOmin。轉(zhuǎn)移上清至吸附柱中，靜置5min， 常溫，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的液體。再加入500yLHBBuffer到吸附柱中，靜 置5min，常溫，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的液體。加入700yLDNAWashBuffer 到吸附柱中，常溫12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中， 重復(fù)此步驟一次。然后將空吸附柱于12000rpm離心3min，室溫瞭干15min。向空吸附柱中 加入30yL超純水，室溫靜置5min，12000rpm離心3min。離心管中的溶液即為質(zhì)粒DNA水 溶液。取3yL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在正確的位置有明顯條帶，剩余DNA樣品于-20°C 貯存。
[0116] 4、海藻糖合酶基因的克隆
[0117] a、PCR切膠回收產(chǎn)物和pET_22b質(zhì)粒的雙酶切
[0118] 分別將惡臭假單胞菌、谷氨酸棒桿菌、天藍(lán)色鏈霉菌和海棲熱袍菌來源海藻糖合 酶PCR切膠回收產(chǎn)物和pET-22b質(zhì)粒分別用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI、NcoI和Hindlll、 BamHI和HindIII、EC〇RI和Sail雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后回收備用（膠 回收采用OMEGA公司MicroEluteGelExtractionKit柱式DNA膠回收試劑盒方法進(jìn)行）。
[0119] PCR切膠回收產(chǎn)物和pET-22b質(zhì)粒的酶切體系均為30yL:DNA片段和質(zhì)粒均為 20yL，ddH20 5yL，酶IlyL，酶IIlyL，10Xbuffer3yL。以上操作在冰上進(jìn)行，混勻 后在水浴鍋上于37°C反應(yīng)lh。
[0120] b、DNA連接反應(yīng)
[0121] 將凝膠回收后的雙酶切PCR產(chǎn)物（由步驟2獲得）和pET-22b載體連接，連接體 系為10yL:雙酶切后的PCR產(chǎn)物5yL，雙酶切后的pET-22b3yL，10XBufferlyL，T4連 接酶1yL。以上操作在冰上進(jìn)行，混勻后在金屬浴上于22°C連接lh。
[0122] c、大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
[0123] 將b中的10yL連接產(chǎn)物與50yL的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min; 42°C熱激90s，立即重置于冰上2min，再加入500yLLB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)40min;涂布 于LB固體平板（含100yg/mL氨芐青霉素），37°C培養(yǎng)過夜。
[0124] d、菌落PCR初步鑒定
[0125] 用移液槍挑取少量單菌落至含20yL滅菌水的PCR管中，混勻后取出10yL保 存，其余的分別加入四種來源的重疊PCR擴(kuò)增DNA片段的上下游引物各1yL、0. 5yL水和 12. 5rTaq〇
[0126] 混合均勻后，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)：95°C30s，56°C30s，72°C2min54s，共35個(gè) 循環(huán)，最后再72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的菌落。
[0127] e、DNA測序及檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的正確性
[0128] 將菌落PCR鑒定為陽性克隆的無菌水保存的菌進(jìn)行4mL試管12~16h培養(yǎng)， 并送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA測序。將測序后獲得的序列用 DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)以驗(yàn)證序列的正確性和該方法的可靠性。測序結(jié)果表明，所獲得的 DNA片段含有改造后的海藻糖合酶基因編碼區(qū)。該四種來源海藻糖合酶基因編碼區(qū)序列 全長分別為2952bp、3072bp、2973bp和2478bp，分別編碼984個(gè)氨基酸、1024個(gè)氨基酸、991個(gè)氨基酸和826個(gè)氨基酸。成功構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pET-22b-pptreS565-tttreSC、 pET_22b-cgtreS_tttreSC、pET_22b-sctreS_tttreSC和pET-22b-tmtreS_tttreSC〇
[0129] 惡臭假單胞菌來源的海藻糖合酶基因編碼區(qū)測序結(jié)果見序列表No. 3。
[0130] 其氨基酸序列見序列表No. 4。
[0131] 谷氨酸棒桿菌來源的海藻糖合酶基因編碼區(qū)測序結(jié)果見序列表No. 7。
[0132] 其氨基酸序列見序列表No. 8。
[0133] 天藍(lán)色鏈霉菌來源的海藻糖合酶基因編碼區(qū)測序結(jié)果見序列表No. 11。
[0134] 其氨基酸序列見序列表No. 12。
[0135] 海棲熱袍菌來源的海藻糖合酶基因編碼區(qū)測序結(jié)果見序列表No. 15。
[0136] 其氨基酸序列見序列表No. 16。
[0137] 5、海藻糖合酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)
[0138]a、將保藏好的測序正確的DH5a菌株接菌于4mL試管，過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒 pET_22b_pptreS、pET_22b_cgtreS、pET_22b_sctreS和pET-22b_tmtreS，米用OMEGA公司 PlamidMinikitI試劑盒小量提取質(zhì)粒，具體操作步驟參見pET-22b質(zhì)粒的小量提取。
[0139]b、分別將a中的10yL重組質(zhì)粒與50yL的大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞 混合，冰浴30min;42°C熱激90s，立即重置于冰上2min，再加入500yLLB液體培養(yǎng)基，37°C 培養(yǎng)40min;涂布于LB固體平板（含100yg/mL氨芐青霉素），37°C培養(yǎng)過夜。
[0140]c、海藻糖合酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)
[0141] 分別挑取步驟c中平板上長出的單菌落，接種于裝有4mLLB的試管中（含 l〇〇yg/mL氨芐青霉素），于37°C。200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接于裝有50mLTB培養(yǎng)基（含 100yg/mL氨芐青霉素）的250mL三角瓶中