用OMEGA公司MicroElute Gel Extraction Kit柱式DNA膠回收試劑盒回收 PCR產(chǎn)物，具體操作步驟同步驟2。
[0192] 5、pET-22b質(zhì)粒小量提取
[0193] 采用OMEGA公司Plamid Mini kit I試劑盒小量提取質(zhì)粒，具體操作步驟為：
[0194] 將實驗室保存的含有pET_22b質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a接種到到4mL含有氨芐青霉 素（100yg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)16h左右。取出菌液加到2mL離心管中，常 溫，12000rpm離心lmin，棄盡上清。加入250yL溶液I，吹打混勻。加入250yL溶液II，上 下輕輕顛倒數(shù)次，混勻，常溫靜置2min。加入350yL溶液III，上下輕輕顛倒數(shù)次，使裂解 物分散均勻，常溫靜置2min，常溫12000rpm離心10min。轉(zhuǎn)移上清至吸附柱中，靜置5min， 常溫，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的液體。再加入500yLHBBuffer到吸附柱中，靜 置5min，常溫，12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的液體。加入700yLDNAWashBuffer 到吸附柱中，常溫12000rpm離心lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一收集管中， 重復此步驟一次。然后將空吸附柱于12000rpm離心3min，室溫瞭干15min。向空吸附柱中 加入30yL超純水，室溫靜置5min，12000rpm離心3min。離心管中的溶液即為質(zhì)粒DNA水 溶液。取3yL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在正確的位置有明顯條帶，剩余DNA樣品于-20°C 貯存。
[0195] 6、海藻糖合酶基因的克隆
[0196]a、重疊PCR切膠回收產(chǎn)物和pET_22b質(zhì)粒的雙酶切
[0197] 分別將惡臭假單胞菌、谷氨酸棒桿菌、天藍色鏈霉菌和海棲熱袍菌來源海藻糖合 酶重疊PCR切膠回收產(chǎn)物和pET-22b質(zhì)粒均用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindllI雙酶切，將谷 氨酸棒桿菌來源海藻糖合酶重疊PCR產(chǎn)物切膠回收產(chǎn)物和pET-22b質(zhì)粒均用限制性內(nèi)切酶 Ncol和HindllI雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后回收備用（膠回收采用OMEGA 公司MicroEluteGelExtractionKit柱式DNA膠回收試劑盒方法進行）。
[0198] 重疊PCR切膠回收產(chǎn)物和pET-22b質(zhì)粒的酶切體系均為30yL:DNA片段和質(zhì)粒均 為20yL，ddH20 5yL，酶IlyL，酶IIlyL，10Xbuffer3yL。以上操作在冰上進行，混 勻后在水浴鍋上于37 °C反應lh。
[0199]b、DNA連接反應
[0200] 將凝膠回收后的雙酶切PCR產(chǎn)物（由步驟2獲得）和pET-22b載體連接，連接體 系為10yL:雙酶切后的重疊PCR產(chǎn)物5yL，雙酶切后的pET-22b3yL，10XBufferlyL， T4連接酶1yL。以上操作在冰上進行，混勻后在金屬浴上于22°C連接lh。
[0201]c、大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化
[0202] 將b中的10yL連接產(chǎn)物與50yL的大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞混合，冰浴30min; 42°C熱激90s，立即重置于冰上2min，再加入500yLLB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)40min;涂布 于LB固體平板（含100yg/mL氨芐青霉素），37°C培養(yǎng)過夜。
[0203] d、菌落PCR初步鑒定
[0204] 用移液槍挑取少量單菌落至含20yL滅菌水的PCR管中，混勻后取出10yL保 存，其余的分別加入四種來源的重疊PCR擴增DNA片段的上下游引物各1yL、0. 5yL水和 12. 5rTaq〇
[0205] 混合均勻后，按以下條件進行PCR反應：95°C30s，72°C30s，72°C2min54s，共35個 循環(huán)，最后再72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證。驗證正確的菌落。
[0206]e、DNA測序及檢驗實驗的正確性
[0207] 將菌落PCR鑒定為陽性克隆的無菌水保存的菌進行4mL試管12~16h培養(yǎng)， 并送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行DNA測序。將測序后獲得的序列用 DNAMAN軟件進行比對以驗證序列的正確性和該方法的可靠性。測序結(jié)果表明，所獲得的 DNA片段含有改造后的海藻糖合酶基因編碼區(qū)。該四種來源海藻糖合酶基因編碼區(qū)序列 全長分別為2952bp、3072bp、2973bp和2478bp，分別編碼984個氨基酸、1024個氨基酸、 991個氨基酸和826個氨基酸。成功構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pET-22b-pptreS565-tttreSC、 pET_22b-cgtreS_tttreSC、pET_22b-sctreS_tttreSC和pET-22b-tmtreS_tttreSC〇
[0208] 帶有嗜熱細菌海藻糖合酶C端的惡臭假單胞菌來源海藻糖合酶基因編碼區(qū)測序 結(jié)果見序列表No. 51。
[0209] 其氨基酸序列見序列表No. 52。
[0210] 帶有嗜熱細菌海藻糖合酶C端的谷氨酸棒桿菌來源海藻糖合酶基因編碼區(qū)測序 結(jié)果見序列表No. 55。
[0211] 其氨基酸序列見序列表No. 56。
[0212] 帶有嗜熱細菌海藻糖合酶C端的天藍色鏈霉菌來源海藻糖合酶基因編碼區(qū)測序 結(jié)果見序列表No. 59。
[0213] 其氨基酸序列見序列表No. 60。
[0214] 帶有嗜熱細菌海藻糖合酶C端的海棲熱袍菌來源海藻糖合酶基因編碼區(qū)測序結(jié) 果見序列表No. 63。
[0215] 其氨基酸序列見序列表No. 64。
[0216] 7、海藻糖合酶基因在大腸桿菌中的表達
[0217]a、將保藏好的測序正確的DH5a菌株接菌于4mL試管，過夜培養(yǎng)，提取重組質(zhì) 粒pET_22b-pptreS565_tttreSC、pET_22b-cgtreS_tttreSC、pET_22b-sctreS_tttreSC和 pET-22b-tmtreS_tttreSC，米用OMEGA公司PlamidMinikitI試劑盒小量提取質(zhì)粒，具體 操作步驟參見pET-22b質(zhì)粒的小量提取。
[0218]b、分別將a中的10 yL重組質(zhì)粒與50 yL的大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞 混合，冰浴30min;42°C熱激90s，立即重置于冰上2min，再加入500 y LLB液體培養(yǎng)基，37°C 培養(yǎng)40min;涂布于LB固體平板（含100 y g/mL氨芐青霉素），37°C培養(yǎng)過夜。
[0219]c、海藻糖合酶基因在大腸桿菌中的表達
[0220] 分別挑取步驟c中平板上長出的單菌落，接種于裝有4mLLB的試管中（含 l〇〇yg/mL氨芐青霉素），于37°C。200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，轉(zhuǎn)接于裝有50mLTB培養(yǎng)基（含 100yg/mL氨芐青霉素）的250mL三角瓶中，于37°C，220rpm培養(yǎng)至0D6QQ為0. 6~0. 8。添 加IPTG至終濃度為0. 5mM/L，于16°C，180rpm繼續(xù)培養(yǎng)30h。平行發(fā)酵數(shù)瓶菌液，培養(yǎng)24h 后取菌液置于50mL離心管中，4°C，6000rpm離心10min，倒掉上清，收集菌體。將離心后的 菌體用10mL1XPBS磷酸鹽緩沖液重懸，置于冰上進行超聲破碎，功率采用130KW，超聲3s， 間歇5s，總共20min，然后采用SDS-PAGE電泳和活性檢測確定重組蛋白的表達和酶活力，分 析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間。
[0221] d、海藻糖合酶活性檢測
[0222] 在最適條件下，以過量的濃度為20%的麥芽糖溶液為底物，反應30分鐘，單位體 積內(nèi)每分鐘轉(zhuǎn)化生成1Umol海藻糖的量為1個酶活單位U。
[0223] 吸取lmL的粗酶液，加入到250mL三角瓶中，然后加入20mL麥芽糖溶液（20%)，最 適溫度（惡臭假單胞菌來源海藻糖合酶是20°C，谷氨酸棒桿菌來源海藻糖合酶是20°C，天 藍色鏈霉菌來源海藻糖合酶是50°C，海棲熱袍菌來源海藻糖合酶是30°C)振蕩反應30min， 100°C沸水浴10min滅活。以標準空白樣為空白對照，高效液相色譜測定海藻糖生成量。結(jié) 果表明，對所長出的重組子進行誘導表達后酶活測定，四種添加嗜熱細菌來源的海藻糖合 酶C端基因片段的惡臭假單胞菌、谷氨酸棒桿菌、天藍色鏈霉菌和海棲熱袍菌來源的海藻 糖合酶的酶活力分別為8204U、10461U、6255U和5915U。
[0224] 實施例3嗜熱細菌來源的海藻糖合酶C端片段對惡臭假單胞菌、谷氨酸棒桿菌、天 藍色鏈霉菌和海棲熱袍菌來源的海藻糖合酶酶活的影響
[0225] 四種通過添加嗜熱細菌來源的海藻糖合酶C端基因片段的惡臭假單胞菌、谷氨酸 棒桿菌、天藍色鏈霉菌和海棲熱袍菌來源的海藻糖合酶的酶活力和原始的海藻糖合酶相比 分別提高了 2. 53倍、5. 58倍、2. 74倍和4. 57倍。因此證明嗜熱細菌來源的海藻糖合酶確 實對其他四種來源的海藻糖合酶酶催化特性產(chǎn)生了一定影響，起著至關(guān)重要的作用。
[0226] 最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解，可以在 形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1.嗜熱細菌海藻糖合酶C端片段提高海藻糖合酶酶活的方法，其特征在于，包括如下 步驟： (1) 嗜熱細菌海藻糖合酶基因編碼區(qū)的克隆及其在大腸桿菌中的表達將惡臭假單胞 菌、谷氨酸棒桿菌、天藍色鏈霉菌和海棲熱袍菌總DNA根據(jù)已知的海藻糖合酶基因編碼區(qū) 序列，設(shè)計一對上下游引物，設(shè)計的引物為： 惡臭假單胞菌來源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22treSBamHF:5'-GGGAAAGGATCC GGCCAAGCGTTCCCGCC-3'，下劃線為 BamHI 酶切位點）， 下游引物 22treSXhoR:5' -GGGAAACTCGAGTGACTCTCCCCAGGTACTGATC-3'，下劃線為 XhoI 酶切位點，； 谷氨酸棒桿菌來源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22cgtreSNC〇F :5' -GGGAAACCAT 迎GCACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCA-3'，下劃線為 NcoI 酶切位點，， 下游引物：22cgtreSHindR : 5 :-GGGAAAAAGCTTTTCCATATCGTCCTTTTCATCGGC-3'，下劃線為 HindIII 酶切位點，； 天藍色鏈霉菌來源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22sCtreSBamHF :5' -GGGAAAOSA TCCGCACCGTCAACGAGCCCGTAC-3'，下劃線為 BamHI 酶切位點，， 下游引物 22sctreSHindR :5' -GGGAAAAAGCTTAGCGCGGCGGCCG-3'，下劃線為 HindIII 酶 切位點，； 海棲熱袍菌來源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22tmtreSEC〇RF :5' -GGGAAAGAATT SGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGC-3'，下劃線為 EcoRI 酶切位點，， 下游引物 22tmtreSSalR :5' -GGGAAAGTCGACCCTCAACAGATCTAAGAAGAGTTTCAGATAG TT-3'，下劃線為BamHI酶切位點，； PCR反應體系為50yL:基因組模板DNA lyL，上下游引物各2yL，dNTP Mix3yL， 2XPrimeSTAR GC Buffering 25 μL, DMSO 0. 75 μL, ddH20 15. 65 μL, PrimeSTARO. 6 μ L ； PCR反應條件為98°C預變性lmin，進行98°C 12s，65°C 10s，72°Cx s，共9個循環(huán)，然后進行 98°C 12s，57°C 30s，72°C X s，共21個循環(huán)，最后72°C延伸3min ;x根據(jù)片段長度設(shè)定Imin 延伸1000 bp ;切膠回收PCR產(chǎn)物并將其克隆至pET-22b上；對所獲得的海藻糖合酶進行測 序，構(gòu)建 pET_22b_pptreS、pET_22b_cgtreS、pET_22b_sctreS 和 pET-22b_tmtreS 質(zhì)粒并實 現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達； (2) 惡臭假單胞菌、谷氨酸棒桿菌、天藍色鏈霉菌和海棲熱袍菌來源的海藻 糖合酶與其融合連接的嗜熱細菌海藻糖合酶C端嗜熱